鳖甲煎丸抗肿瘤血管生成的实验研究
鳖甲煎丸出自东汉医家张仲景所著《金匮要略》，是破瘀化痰，扶正消Y之剂。据报道鳖甲煎丸在治疗肝癌、食道癌、白血病、子宫肌瘤等等有较好的疗效。
分析鳖甲煎丸的药物组成，以破血、化瘀、散结之品为多。这些破血化瘀散结之品对肿瘤有什么作用，是否会促进肿瘤血管生成以及肿瘤转移，这是值得我们认真探讨的问题。
我们通过对建立荷瘤小鼠动物模型进行体内中药干预，观察荷瘤小鼠瘤块微血管计数(MDC)、血管内皮生长因子(VEGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况，来说明鳖甲煎丸对肿瘤血管的影响。
1、 材料与方法 1.1 实验动物:昆明种小鼠60只，4～6周龄，体重18～22g，雄性，购于广州中医药大学动物中心。
分笼饲养，自由摄食、饮水，鼠房保持通风。 1.2 细胞株:细胞株为小鼠腹水型肝癌细胞株H22细胞，皮下接种可生成肉瘤。
购于中山大学医学院肿瘤研究所，常规复苏传代培养。 1.3 主要试剂: PCNA一抗、VEGF一抗及试剂盒，均为武汉博士德生物工程有限公司产品。
1.4 药物的制备:鳖甲煎丸，杭州胡庆余堂有限公司生产，批号020602。根据人与小鼠药物剂量换算公式算出小鼠每日给药剂量。
用蒸馏水将鳖甲煎丸分别配成每毫升含0.048g 、0.024g生药的高、低两个剂量组的悬浊液，4℃冰箱保存，用时摇匀。
环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号02071121。用无菌生理盐水将环磷酰胺稀释成为2mg/ml，4℃冰箱保存。
1.5 荷瘤小鼠模型的建立[1]:体外复苏培养H22细胞:按常规制成细胞悬液。调整到2～3×106/ml个瘤细胞，随机选取10只健康昆明种小鼠，每只用上述细胞悬液0.4ml腹腔注射，约一周后接种小鼠腹部明显涨大、凸出。
将其颈椎脱臼处死，固定于蜡板上，无菌抽取乳白色腹水液，经稀释、染色后，调整瘤细胞悬液浓度为6×106/ ml个瘤细胞，每只小鼠右后肢臀部皮下接种0.2ml。
共接种44只小鼠。24小时后用药。 1.6 实验分组和给药:将44只造模成功的小鼠随机分为4组，每组11只，组内编号。
4组分别为:鳖甲煎丸高剂量组、鳖甲煎丸低剂量组、阴性对照组及环磷酰胺组。所有处理自造模第二天开始:鳖甲煎丸高、低剂量组分别按12g？
kg-1？d-1、6g？kg-1？d-1灌胃，阴性对照组给相同剂量的蒸馏水灌胃，环磷酰胺组按20mg？kg-1？
d-1腹腔注射[2]。连续用药15天后停药，处死小鼠后剥离瘤块，10％甲醛固定。 1.7 取材的处理:包括固定、脱水、浸蜡、包蜡、切片。
1.8 结果判断:肿瘤内微血管计数(MDC):于每只荷瘤小鼠瘤体内的5个不同部位取材，每块5mm×5mm×2mm，排除肿瘤出血区及边缘反应区。
应用HE染色，低倍镜观察确定每例切片中3个血管计数最高区域，然后在高倍镜下记数热点区域内每高倍镜视野的MDC。为了避免较大血管对计数的干扰，对管壁有较厚平滑肌包绕或管腔8个红细胞面积的血管不予计数。
其平均值即为该例肿瘤的MDC值[3]。 PCNA的阳性判断标准，细胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性反应，每个标本随机观察10个高倍镜视野，计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为PCNA的阳性细胞数[4]。
VEGF以细胞浆内出现棕黄色为阳性，算阳性区域面积占瘤细胞总面积的百分率表示。 2 、结果 2.1 鳖甲煎丸对肿瘤组织微血管计数(MDC)的影响 如表1所示:与阴性组相比较，鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组MDC均明显降低(P0.01)。
而环磷酰胺组MDC与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)。鳖甲煎丸高剂量组MDC明显低于鳖甲煎丸低剂量组MDC(P0.01)。
鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组MDC均明显降低，与环磷酰胺组相比较有显著性差异(P0.01)。 表1鳖甲煎丸对肿瘤组织微血管密度(MDC)的影响( ) 组别 n 始 末 剂量 (g/kg) MDC (条) 阴性对照组 11 11 - 15.7±2.3 环磷酰胺组 11 11 20 14.6±2.2 鳖甲煎丸高剂量组 11 11 12 4.1±1.2*▲△ 鳖甲煎丸低剂量组 11 11 6 7.6±1.4*△ 注:与阴性对照组比较:*P0.01;与鳖甲煎丸低剂量组比较:▲P0.01; 与环磷酰胺组比较: △P0.01 2.2 鳖甲煎丸对肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)的影响 VEGF的表达，鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组均显著弱于阴性对照组(P0.01)。
鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组VEGF的表达明显减弱，与环磷酰胺组相比较有显著性差异(分别为P0.01，P0.05)。
鳖甲煎丸高剂量组与鳖甲煎丸低剂量组比较，其VEGF的表达亦明显减弱(P0.01)。结果见表2: 表2鳖甲煎丸对肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)的影响( ) 组别 n 始 末 剂量 (g/kg) VEGF (％) 阴性对照组 11 11 - 13.18±1.47 环磷酰胺组 11 11 20 9.18±3.40* 鳖甲煎丸高剂量组 11 11 12 2.36±1.12*△△▲ 鳖甲煎丸低剂量组 11 11 6 5.91±1.38*△ 注:与阴性对照组比较:*P0.01;与环磷酰胺组比较: △P0.05 ，△△P0.01; 与鳖甲煎丸低剂量组比较:▲P0.01 2.3 鳖甲煎丸对肿瘤组织增殖细胞核抗原(PCNA)的影响 如表3所示，PCNA的表达鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组与阴性对照组比较均显著减弱(P0.01)。
与环磷酰胺组相比较，鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组PCNA表达均明显减弱(P0.01)。鳖甲煎丸高剂量组PCNA表达明显弱于鳖甲煎丸低剂量组(P0.01)。
表3鳖甲煎丸对肿瘤组织细胞增殖核抗原(PCNA)的影响( ) 组别 n 始 末 剂量 (g/kg) PCNA (％) 阴性对照组 11 11 - 57.45±2.16 环磷酰胺组 11 11 20 34.18±2.64* 鳖甲煎丸高剂量组 11 11 12 12.90±4.16*△▲ 鳖甲煎丸低剂量组 11 11 6 22.73±2.83*△ 注:与阴性对照组比较:*P0.01;与环磷酰胺组比较:△P0.01;与鳖甲煎丸低剂量组比较:▲P0.01 3 、讨论 肿瘤血管生成涉及多个方面，用单一途径的药物很难奏效，因此是较难解决的问题。
鳖甲煎丸由多种药物组成，靶点是多方面的，包括调理整体机能状态，攻击局部的病邪，扶助正气，散除肿块，已被临床证明是有效的经方。
该方含有大量的破血化瘀散结药，如破血化瘀散结的大黄、紫葳、土鳖虫、蜣螂、鼠妇、丹皮、桃仁;软坚散结的鳖甲、半夏、葶苈子、乌扇、赤硝;解毒散结的蜂房;清热散结的黄芩、柴胡。
这些药物对肿瘤血管生成是促进还是抑制需要通过实验证明。 肿瘤的生长、浸润和转移等均需新生毛细血管网的支持。恶性肿瘤细胞依靠丰富的新生毛细血管网及时得到其迅速无限生长所需的养料和氧气，并将代谢产物运走。
肿瘤在生长过程中可分泌侵蚀血管并促进新生血管形成的物质。 VEGF是一种特异性作用于内皮细胞的多功能因子，对诱导和调节肿瘤血管形成有重要作用。
VEGF能增加血管尤其是微血管的通透性[5]，为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络。VEGF是一种选择性促血管内皮细胞有丝分裂原[6]，直接刺激内皮细胞增殖，并产生纤维蛋白原激活剂和胶原酶，这不仅可促进内皮细胞活动，有利于血管生成，而且还有利于肿瘤细胞脱落进入血管或向邻近组织扩散，为肿瘤的浸润转移创造条件。
VEGF已作为一种反映肿瘤血管生成，判断肿瘤生物异质性的预后指标。 本实验应用免疫组织化学的方法，检测荷瘤小鼠瘤块中VEGF的表达情况。
结果显示:鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组VEGF的阳性率均显著低于阴性对照组(P0.01)。与环磷酰胺组相比较，鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组的VEGF的表达亦明显减弱(分别为P0.01，P0.05)。
鳖甲煎丸高剂量组与鳖甲煎丸低剂量组间亦有显著性差异(P0.01)。说明鳖甲煎丸对该荷瘤小鼠体内VEGF的表达有显著的抑制作用，且呈一定的量效趋势。
血管密度的增加，增加了肿瘤细胞进入循环的机会，肿瘤细胞较容易穿过这些血管向远处转移[7]。本实验显示:鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组的微血管计数均明显降低，与阴性对照组MDC有显著性差异(P0.01)。
而环磷酰胺组MDC与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)。鳖甲煎丸高剂量组MDC明显低于鳖甲煎丸低剂量组(P0.01)。
这说明鳖甲煎丸对荷瘤小鼠肿瘤血管有抑制作用。 PCNA是伴随细胞增殖而表达的一种核内蛋白。正是PCNA的这一生理功能，可以作为一项评估细胞增殖状态的指标而被广泛用于恶性肿瘤的研究。
PCNA作为一个内源性增殖细胞的标记物，与恶性肿瘤的增长活性、转移及预后有密切关系。检测恶性肿瘤组织PCNA表达对判断肿瘤的恶性程度、预测淋巴结转移趋势、指导临床的治疗方案，以及改善患者预后均有重要意义[8]。
本实验应用免疫组织化学的方法，检测荷瘤小鼠肿瘤组织PCNA的表达，探讨经方鳖甲煎丸对肿瘤组织中PCNA影响。结果显示:鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组PCNA的表达与阴性对照组比较均显著减弱(P0.01);与环磷酰胺组相比较亦明显减弱(P0.01)。
鳖甲煎丸高剂量组PCNA的表达明显弱于鳖甲煎丸低剂量组(P0.01)。这些说明鳖甲煎丸对该荷瘤小鼠体内PCNA的表达有显著的抑制作用，且呈一定的量效趋势。
4 、结论 鳖甲煎丸可以显著降低荷瘤小鼠肿瘤的微血管计数，这说明鳖甲煎丸可通过抑制荷瘤小鼠肿瘤的血管生成来达到抑瘤作用的。
鳖甲煎丸抑制肿瘤血管生成可能是通过抑制肿瘤VEGF来实现的。鳖甲煎丸可以显著抑制荷瘤小鼠肿瘤PCNA的表达，这可能亦是鳖甲煎丸抑制肿瘤生成的原因之一。