科研 | Cell Metab.：肥胖通过肠道菌芳香氨基酸代谢损害短期和工作记忆
编译：董邦健，编辑：Emma、江舜尧。
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近年来，人类预期寿命以及肥胖症等相关代谢类障碍的患病率增加，全世界范围内认知功能下降问题越来越突出。而肥胖已被确定为认知障碍的危险因素。本研究根据肥胖状况探索肠道菌群与记忆的关系。发现与短期记忆、工作记忆、海马区和额叶区体积相关的特定微生物组在肥胖和无肥胖的人类受试者中存在差异，血浆和粪便中的芳香族氨基酸、其分解代谢物和植物衍生化合物的水平与短时记忆和工作记忆有相关性。肥胖人群菌群移植可导致小鼠的记忆得分下降，这与人类和受体小鼠的特征一致。小鼠内侧前额叶皮层的RNA-Seq显示，短期记忆与芳香氨基酸通路、炎症基因和菌群种类有关。这些结果突出了靶向肠道菌群对于记忆力受损的潜在治疗价值，尤其在肥胖患者中。
论文ID
实验设计
通过比较肥胖以及非肥胖患者细菌功能，记忆分数以及大脑区域三者之间的关联，确定出与记忆相关的细菌代谢功能，最后通过菌群移植来验证推测。
实验结果
1. 肠道宏基因组分析揭示了细菌基因功能和种类与记忆分数相关
对116名中年受试者(肥胖65人，非肥胖51人)的记忆功能进行了评估(表1)。根据加利福尼亚州非文字学习测验立即召回（CVLT-IR），加利福尼亚州非文字学习测验短暂延迟免费召回（CVLT-SDFR）和总数字跨度（TDS）得分，观察到肥胖受试者的学习，即刻回忆，短暂延迟回忆和工作记忆受损（图1A，1B和S1A；表1）。在调整了年龄，性别，BMI，受教育年限和使用患者健康问卷（PHQ）-9评估的抑郁评分后，使用DESeq2（Love等人，2014）将特征性微生物组生态系统与认知评分相关联（图1C–1F，S1B和S1C；表S1A–S1F）。为了考虑微生物组数据的组成结构并排除可能的虚假关联，研究者使用ALDEx2 R包中的组成单变量方法（表S2）以及基于中心对数比转换数据的多元机器学习特征选择策略进一步分析了数据。普通物种与学习和非文字记忆以及工作记忆呈正相关。如Clostridium sp. 27_14或Clostridium sp. CAG:230，都属于厚壁菌门。相反，在拟杆菌和变形菌门中发现了肠道菌群和记忆分数之间的负相关关系。值得注意的是，虽然一些物种与语言学习有积极的和特定的联系，如Ruminococcus sp. CAG:353, Roseburia sp. CAG:197等(图1C和S1B；表S1A)，其他与工作记忆呈正相关，但与学习记忆和语言记忆无显著相关(梭状芽孢杆菌CAG:440, Ruminococcus CAG:177，厚壁菌门CAG:103) (图1D;表S1C、S2B、S3B)，这表明不同的记忆域。值得注意的是，一些被鉴定的细菌种类也与一年后测量的几个记忆域纵向相关，如表2所示。
表1 人队列的临床和神经心理学数据
表2 后续人临床和神经心理学数据
记忆认知特征不仅与微生物群的组成有关，还与宏基因组的功能有关。有关维生素B代谢例如核黄素，维生素B6，叶酸和维生素B12的细菌功能，与所有记忆区域呈负相关关系[萬小萬3] （在图1E，1F和S1中以及表S1D–S1F中以黑色突出显示）。值得注意的是，这些维生素都是单碳代谢所必需的，B族维生素尤其是硫胺和叶酸与认知之间的关联已得到公认。参与硫胺素(维生素B1)代谢的细菌功能也与低记忆分数有关，研究者推测这些功能会导致肠道细菌对硫胺素的优先吸收或分解代谢，从而导致宿主对硫胺素的吸收减少。与此同时，在记忆力得分较低的受试者中发现血浆硫胺水平明显较低，与AAA代谢、单碳代谢和内源性大麻素信号传导等相关（图1E、1F和S1C中高亮显示）的记忆域与其他宏基因组功能也有关联。
当研究者分别评估肥胖和非肥胖受试者的关联性时（图1G–1N和S1D–S1G；表S1G–S1R，S2C–S2F和S3C–S3F），研究者发现了几个Prevotella菌与非肥胖受试者的非文字记忆力呈正相关（图1G和S1D；表S1G，S1O，S2C和S3C），Eubacterium和Clostridium菌在肥胖受试者中显示出类似的趋势（图1I和S1E；表S1I，S1Q和S2D）。变形杆菌门细菌在非肥胖和肥胖者同样呈负相关，但更倾向于后者(图1G和1I；表S1I和S3D)。在工作记忆方面，研究者观察到Selenomonadaceae，Lactococcus和Colinsella菌在非肥胖受试者中(图1K；表S1K、S2E、S3E)以及真细菌、瘤胃球菌、梭状芽孢杆菌和粪杆菌在肥胖受试者中呈正相关(图1M;表S1M, S2F, S3F)。与硫胺素相关的细菌功能在肥胖人群中更聚集(图1J和1N；表S1J，S1N，S2J，S2L，S3J，和S3L)，这些人特别易受硫胺缺乏症影响。总之，厚壁菌门的几种(属于梭状芽孢杆菌、瘤胃球菌、真细菌属和硒单胞菌科)与记忆得分呈正相关。而拟杆菌门和变形杆菌门主要与记忆得分呈负相关。
在此之前还没有关于肠道菌群与人类不同记忆域有关的报道。当前研究结果与报道轻度认知障碍患者中拟杆菌丰度较高一致。肠杆菌如啮齿类柠檬酸杆菌，与急性应激下的记忆力受损有关。在胰岛素抵抗和肥胖受试者中，活泼瘤胃球菌，拟杆菌属和肠杆菌属种类有所增加，并且与低认知特征相关联。相反，在2型糖尿病患者中，与较高记忆力评分有关的厚壁菌门，如Clostridiales和Roseburia相对丰度较低，在小鼠中，鼠李糖乳杆菌和Helveticus的联合给药可增加非空间记忆，改善海马中c-Fos表达。
图1 一个特征的与记忆分数相关，并由肥胖状态调节的微生物分类和功能概况
（A和B）患有和不患有肥胖症的受试者的总数字跨度（TDS）（A）和加利福尼亚语言学习短时自由回想（CVLT_SDFR）（B）的箱线图。根据IRONMET队列中宏基因组测序通过DESeq2计算的，与CVLT_SDFR（C）和TDS（D）相关的细菌丰度差异的火山图，并针对年龄，BMI，性别，受教育年限和年龄患者健康问卷（PHQ）-9得分进行了调整。在相应的测试中，与单位变化相关的折叠变化(FC)和本杰明-霍克伯格调整p值(pFDR)被绘制为每个分类单元。根据门的不同，类群有明显不同的颜色。与CVLT_SDFR (pFDR < 0.002) (E)和TDS (pFDR< 0.04) (F)相关的显著表达KEGG细菌基因的曼哈顿样图，通过调整年龄、BMI、性别、受教育年限和PHQ-9的DESeq2分析确定。将-log10(pFDR)值乘以FC符号，以考虑关联的方向。条是根据pFDR着色的。与B族维生素代谢、单碳代谢、苯丙氨酸、色氨酸、内源性大麻素代谢相关的功能用黑色标出。(G-N)在肥胖和非肥胖受试者中CVLT_SDFR和TDS测试的分类和功能相关性。显著相关的物种和元基因组功能的完整列表可在表S1中找到。
2. 脑结构与非肥胖和肥胖者肠道菌群以及功能的不同联系
研究者用MRI评估了143名受试者的语言记忆和工作记忆不同脑区容量(见表S4)。在调整了年龄，BMI，性别，总颅内体积（TIV）和PHQ-9之后（从现在开始，术语“已调整”将指这些调整），发现所有受试者非文字和学习记忆能力与左右海马体以及右额下眼眶（FIO）的体积相关（图2A）。尽管未发现与额叶区域有显著相关性，但在非肥胖受试者中与海马也显著呈正相关性（图2B–2D）。相反，工作记忆（TDS）与所有受试者的左FIO体积（图2A）以及非肥胖者的其他额叶区域（图2B，2E和2F）呈正相关。值得注意的是，在肥胖个体中未观察到这些记忆域与脑容量之间的显著关联。一年后评估发现，69名参与者的基线语言和学习记忆（在CVLT测试中自由检索单词）与左右海马体积之间的关系经调整后也很显著。这些发现强调了与语言记忆和工作记忆有关的不同大脑结构，并与之前将语言记忆表现与大脑前额叶和颞叶特征(如海马体)联系在一起的报告一致。有趣的是，还发现了几种Roseburia菌与非文字记忆力呈正相关，与调整后的左海马体积直接相关，而拟杆菌属，非文字记忆分数和左海马的调整体积呈负相关（图2G；表S5A）。
另一方面，Acetitomaculumruminis与工作记忆和调整的右侧FIO区域体积相关（图2H;表S5D），然而数个拟杆菌属（Bacteroides菌）似乎与语言和工作记忆以及调整后的左海马区和右FIO区域体积呈负相关关系（图2H；表S5A和S5D）还发现了几种细菌功能，与记忆评分和调整后的体积（正向和负向）一致相关，值得注意的是，与硫胺代谢相关的功能与调整后的右FIO体积相关。
与海马体积相关的宏基因组功能也与非文字记忆相关，而与FIO体积相关的功能也与工作记忆相关。此外，菌群分类和宏基因组学功能不仅在基线，而且在后续中与大脑区域和记忆域的体积有关（图S3A–S3D；表S5G–S5J）。当分别评估有肥胖者和没有肥胖者时，发现与口语和工作记忆显著相关的几种细菌功能也分别与无肥胖（以粗体显示）受试者调整后的左海马体（图2K）和右FIO体积（图2L）相关。肥胖受试者的宏基因组功能与这些脑容量之间未发现关联，这与肥胖受试者的记忆力测试与所选脑容量之间缺乏显著关联是相符的。
初步证据表明，动物模型中共生细菌与脑形态特征有关。此外，单个时间点的肠道菌群组成与人类的多个脑部特征有关。例如，与当前发现一致，Tillisch及其同事（2017）发现健康妇女中拟杆菌含量与海马中更大的灰质含量有关。在肠易激综合症患者中，Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度显示与（眼眶和三角肌部分）的灰质体积以及颞皮质相关。
图2 肠道菌群与大脑结构有关
（A和B）热图显示了TDS和CVLT_SDFR测试与所有肥胖（A）和没有肥胖的受试者（B）选定大脑体积之间的局部相关性（根据年龄，性别，BMI，受教育年限，PHQ-9和总颅内体积[TIV]进行了调整）。显着的关联以叉号表示：+，p <0.05；++ p ＜0.01。在肥胖个体中未发现统计学上显着的关联，也未显示。（C，D，E和F）控制上述协变量后，左海马体积与CVLT_SDFR（C和D）呈正相关，而右额下眶体积与TDS（E和F）呈正相关。当仅考虑没有肥胖的个体时，这两个关联的标记更为明显。（G和H）由DESeq2计算的与左海马体积（G）和右额下眶体积（H）相关的细菌丰度差异的火山图，控制协变量。为每个分类单元绘制与相应体积中单位变化和Benjamini-Hochberg调整后的p值（pFDR）相关的倍数变化（FC）。根据门系，明显不同的分类单元着色，与记忆域相关联的分类单元以粗体突出显示。(I和J)与左海马体积(I)和右额下眶体积(J)相关的显著表达KEGG细菌基因的曼哈顿样图，由协变量调整DESeq2分析确定。将-log10(pFDR)值乘以FC符号，以考虑关联的方向。条是根据pFDR着色的。与几个认知领域相关的元基因组功能用粗体标出。（K和L）对没有肥胖的个体的左海马体积（K）和右额下眶体积（L）进行相同功能分析的结果。相关功能的完整列表可在表S5中找到。在肥胖者中，未发现这些脑容量有明显的功能关联。
3. 肥胖与非肥胖受试者的记忆分数与血浆/粪便代谢组学和细菌功能的差异相关
研究者使用基于机器学习变量选择技术随机森林进行了代谢组广泛关联研究（MWAS），以识别记忆力测试相关的血浆（图3A–3H，S4A–S4H和S5A-S5H）和粪便（图3I–3P，S4I–S4P，和S5I–S4P）代谢物。所有记忆域的分数都与AAAs色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸及其分解代谢物的血浆水平变化有关。这些AAAs是血清素和多巴胺的前体氨基酸，这两种神经递质在中枢神经系统中起关键作用。多巴胺能和5-羟色胺能传入神经广泛参与认知有关的大脑区域，例如海马和PFC，这两个神经传递的改变均与学习和记忆障碍有关。色氨酸和酪氨酸均与记忆评分呈正相关。这一发现与过去的研究结果相吻合，在过去的工作中，口服色氨酸可改善啮齿动物的记忆获得，巩固和储存。
先前研究表明，抗生素治疗引起的微生物群改变会导致猪下丘脑中AAA浓度和血清素和多巴胺水平下降。肠道菌群还可将色氨酸直接代谢成几种吲哚衍生物，它们是芳烃受体（AhR）的有效配体。AhR缺失会改变成年海马神经发生和前后恐惧记忆。研究者发现几种吲哚衍生物与记忆分数呈正相关，此外，还发现了与色氨酸和苯丙氨酸代谢有关的几种细菌功能与不同的记忆域呈负相关（图S1H和S1I；表S1D–S1F），特别是与色氨酸转运蛋白相关的功能，如色氨酸特异性转运蛋白(mtr)和低亲和力色氨酸渗透酶(tnaB)与CVLT-SDFR呈负相关。奎酸脱氢酶(quiA)，参与色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸代谢，与CVLT有最强的负相关性。值得注意的是，到目前为止，最强的TDS评分负相关性为粪便奎尼酸，其次是色氨酸(图S4I和S4J)。粪便色氨酸与记忆力评分之间的负相关可能与其转化为色氨酸代谢产物（见下文）或其系统吸收增加有关。
有趣的是，色氨酸代谢中与记忆有关的改变仅在肥胖者中观察到，与肥胖者中色氨酸相关宏基因组功能与记忆域的关联相一致，而在非肥胖者中则未观察到。慢性低度炎症是肥胖症的标志，并且肥胖与认知能力下降之间的关系最近已证明是由炎症介导的。一致地，研究者发现BMI与hs-CRP之间存在强正相关（R = 0.71）。值得注意的是，超过90％的色氨酸通过犬尿氨酸途径代谢，在炎性条件下被激活。与此相应，血浆色氨酸水平与hs-CRP呈负相关。重要的是，菌群衍生产物，包括吲哚，在吲哚胺2,3-双加氧酶（kynurenine途径中的限速酶）(IDO)的激活中发挥关键作用。先前有证据表明，这些代谢物在实验模型中具有抑制中枢神经系统星形胶质细胞炎症的作用。据研究者所知，目前的观察是人类首次将色氨酸及其代谢物与认知联系起来。
胆碱能系统还与注意力和记忆等认知过程有关。因此，胆碱是神经递质乙酰胆碱的前体，但它也可以代谢为单碳代谢和同型半胱氨酸状态调节剂中的关键甲基供体-甜菜碱，其血浆水平升高与学习和记忆缺陷有关。因此，补充甜菜碱可以通过改变额叶皮层中MMP-9的活性来防止同型半胱氨酸诱导的记忆损伤。与此一致的是，研究者发现循环中的甜菜碱水平与记忆分数相关。甜菜碱水平的变化与认知域，胆碱，甜菜碱转运体如（例如胆碱/甜菜碱转运蛋白（betT和betS），甜菜碱/脯氨酸转运系统ATP结合蛋白（proV）和甜菜碱/脯氨酸转运系统底物结合蛋白（proX）所涉及的几种宏基因组学功能之间的关联一致（表S1D–S1F）。此外，胆碱脱氢酶(betA)基因（负责将胆碱转化为甜菜碱）是与短期和即时记忆最相关的功能之一。有趣的是，研究者还发现了与参与单碳代谢，同型半胱氨酸水平，认知的B族维生素代谢有关的几种宏基因组功能改变，主要是B2，B6，B9和B12。
与不同记忆域呈正相关的其他代谢产物是内源性大麻素油酰胺和花生四烯酰乙醇酰胺（AEA，阿南酰胺）。内源性大麻素是脂源性介质，在神经传递中起关键作用。因此，大量的证据表明，内源性大麻素系统在调节认知，特别是在学习和记忆功能方面的作用。已报道Anandamide可以逆转啮齿动物的海马损伤和记忆障碍，并保护神经元免受淀粉样蛋白B的细胞毒性作用。同样，给予油酰胺可明显逆转小鼠的记忆力和认知障碍。有趣的是，研究者发现微生物N-乙酰磷脂酰乙醇胺磷脂酶D（NAPEPLD）（图1F和4H；表S1D和S1F）是脂肪酸乙醇酰胺（包括内源大麻素）的生物合成所必需的（Basavarajappa，2007年），与人与小鼠的认知域都有最强之一的关联。
图3 电喷雾电离(ESI)阳性模式下与记忆域相关的血浆和粪便代谢组学
（A，E，I和M）与血浆CVLT_SDFR（A），血浆的TDS（E），粪便的CVLT_SDFR（I）和粪便中的TDS（M）相关的代谢物的标准化排列重要性的箱线图，通过机器学习在500次迭代中的每一次迭代中均基于Boruta选择随机森林算法进行机器识别。（B，F，J和N）交叉验证的置换变量重要性（CVPVI）测量每种代谢物与血浆（B）的CVLT_SDFR测试，血浆（F）中的TDS，粪便的CVLT_SDFR（J）和粪便中的TDS（N）的3种联系符号。（C，D，G，H，K，L，O和P）归一化置换重要性度量，分别用于测量有和没有肥胖的个体血浆中CVLT_SDFR（C和D），血浆TDS（G和H），血浆CVLT_SDFR（K和L），粪便中的TDS（O和P）相关的Boruta选定代谢物。所有代谢物均根据准确的质量，保留时间和MS / MS谱图进行鉴定，只有带有*的代谢物仅根据准确的质量和保留时间进行鉴定。3-IAAld，吲哚-3-乙醛; AEA，花生四烯基乙醇酰胺；CA，胆酸；CDA，鹅去氧胆酸；FA，脂肪酸。
4. 微生物菌群从人到小鼠的移植效果
研究者测试了微生物群对小鼠记忆力评分的可能影响。本研究中使用的小鼠行为模型评估了两种不同的记忆任务。提示诱发的恐惧调节是一种公认的情绪记忆模型（Sun等人，2020年），而新颖的物体识别范式是一种广泛使用的具有不同神经生物学底物的记忆模型。具体而言，提示诱发的恐惧条件通过评估小鼠将中性提示与厌恶经历相关联的能力来评估情绪记忆，其中行为反应主要由杏仁核介导。相比之下，海马在新型物体识别范例中评估的记忆反应中起着至关重要的作用。在这个范例中评估的长期记忆痕迹与空间记忆有关，而与情绪方面无关。
使用V迷宫执行新颖的对象识别认知任务，因为与使用开放领域进行此行为相比，行为响应的准确性和可靠性得到了提高。在这个任务中，老鼠的探索被引导到位于V迷宫两端的两个不同的物体。
22名受试者(11名记忆力得分低，11名记忆力得分高，与年龄、性别、BMI和PHQ-9得分相匹配)的微生物群(表S6)以盲法口服给个体小鼠(执行该实验的研究者在粪便来源上是盲的)。与盐水对11只对照组小鼠记忆的影响进行了比较。所有小鼠均用抗生素预处理14天(图4A)。接受FMT的老鼠对新物体的得分更高，24小时的识别测试(NOR24 h)和较对照组小鼠更低的冷冻总分(图4B和S6A)。有趣的是，与肥胖供体（p = 0.026）和对照小鼠（p = 0.009）相比，来自非肥胖供体的微生物群导致NORII24 h分数显著提高（图4C）。值得注意的是，供者的CVLT-SDFR和CVLT-Short Delayed CuedRecall得分均与受体小鼠的NOR24 h得分显著相关（图4D和4E）。来自捐赠者微生物群的细菌物种，包括Akkermansiasp.和Subdoligranulum sp（NOR3 h）（图4F；表S7A），以及梭状芽孢杆菌，瘤球菌和Roseburiasp。（NOR24 h）（图4G；表S7B）与受体小鼠的记忆分数增加相关，而拟杆菌属（Bacteroides菌）与这个分数负相关，这些拟杆菌与冷冻总分呈正相关。值得注意的是，一些捐赠者的宏基因组功能，包括NAPEPLD，与供体TDS记忆域和受体小鼠的NOR24 h评分相关。此外，与人源研究结果相符，其他相关功能包括与维生素B6（pdxJ和pdxB），B12（btuB）和色氨酸代谢（trpA和trpB）相关的功能（表S7C）。最后，小鼠PFC的RNA测序突出了几个与NOR3 h评分相关的重要基因(图4I;表S7D)。在测试阶段，记录不同的记忆分数:3小时后对小鼠进行短期记忆研究(nor3 h)和24 h后为长期记忆(nor24 h)。值得注意的是，负FC最高的基因是运甲状腺素蛋白（ttr），已证明该蛋白改变了海马表达，与年老动物的记忆缺陷有关。FC第二高的基因是slc6a3，它编码一种多巴胺转运体。此外，NORI3 h与5HT受体基因htr1a和htr2a以及叶酸受体基因folr1之间存在直接关联，进一步强调了AAAs，叶酸代谢和记忆之间的联系。核因子基因nfkb1，在炎症级联反应和记忆巩固中至关重要（Snow等人，2014），也与短期记忆直接相关。而dicer1与这种记忆特征负相关。与此相关，dicer1基因的敲除已被报道可增强记忆。最后，acss2和hdac1与短期记忆直接相关，证实了最近观察到的组蛋白乙酰化与联想学习之间的关系。有趣的是，与NORI3 h相关的记忆基因的表达同时与不同的细菌簇相关且方向相同（图4J）。
图4 人类捐赠者和接受者的小鼠记忆通过微生物群排列一致
(A)粪便微生物群移植(FMT)研究的实验设计。来自低记忆(n = 11)和高记忆(n = 11)人类捐赠者的微生物群被移植到接受抗生素治疗14天的受体小鼠中。11只对照组小鼠用生理盐水处理。之后进行认知测试4周。（B和C）比较空白对照组和FMT组（t检验）的新颖对象识别测试的小提琴图（B），并将对照组与接受和不接受肥胖的人类供体的微生物群进行比较（单因素方差分析）（C）。(D和E)人类的加利福尼亚非文字学习测试(CVLTs)和小鼠的NOR24 h之间的Spearman相关性。（F和G）根据DESeq2分析，与受体小鼠NOR3 h（F）和NOR24 h（G）相关的人类供体细菌丰度差异的火山图。为每个分类单元绘制了与相应记忆测试和本杰米尼·霍奇伯格（Benjamini Hochberg）调整的p值（pFDR）单位更改相关的FC。根据门中显著不同的分类单元进行着色。（H）曼哈顿样地，仅显示与小鼠NOR24小时试验相关的显着表达的KEGG细菌基因（pFDR <0.05），这些基因也与人类的总数字跨度得分相关。将-log10（pFDR）值乘以FC符号以考虑关联的方向。条形根据pFDR着色。表S5C中列出了显着相关的细菌基因的完整列表。（I）与NOR3 h相关的前额叶皮质（PFC）基因的火山图。为每个基因绘制了与NOR3 h测试中的单位变化相关的FC和BenjaminiHochberg调整的p值（pFDR）。那些具有最高FC和最低pFDR值的基因被突出显示。根据文献还强调了可能在记忆中起作用的基因。（J）小鼠细菌物种和与NOR3 h相关的选定PFC基因之间的相关热图。使用欧氏距离和Ward连锁进行聚类。确定并突出显示了三个具有强相关性的细菌簇。
结论
当前发现表明存在一个与语言和工作记忆同时相关的细菌生态系统，大脑区域体积与包括血浆/粪便色氨酸，微生物群驱动的色氨酸代谢产物以及PFC中5-HT受体的表达等特征相关。鉴定的几种物种先前与健康饮食评分呈正相关（Roseburia, Subdoligranulum和Faecalibacterium）和（Fusobacterium和Bacteroides）负相关，与当前研究记忆分数增加和降低的方向相同。这些发现表明，双向宿主/微生物生态系统会影响大脑生理，从这个意义上说，从人类到小鼠肠道菌群表型复现了记忆特征。