编译：微科盟如风，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
尽管室内微生物群影响着我们的健康和福祉，但一旦人类微生物群从人类宿主转移出去，就会发生分类和功能转变，在这一方面仍有许多未知之处。牙刷是研究口腔微生物群对建筑环境条件的潜在反应的一个模型。在这里，我们描述了34名受试者的牙刷的宏基因组，以确定牙刷微生物群、耐药性和可能的影响因素。牙刷微生物群通常包括人类口腔菌群的一个主导子集和较少的或地点特定的环境菌株。虽然牙刷菌群的分类多样性低于口腔相关菌群(通过与人类微生物组计划的比较确定)，但它们有相对广泛的抗菌素耐药性基因(ARG)图谱。牙刷的耐药性富含ARGs，特别是那些导致多药外排和对三氯生的公认耐药性的ARGs，这主要归因于通用的环境类群。牙刷微生物群落的组成和抗性与个人健康、牙齿卫生和浴室功能相关的因素有关。建筑环境中的选择性压力可能塑造人类(主要是口腔相关的)和环境微生物群的动态混合物，它们在牙刷上相遇。牙刷具有不同于人类口腔的微生物多样性和耐药性，这表明牙刷有可能成为ARG的转运载体。本研究发现牙刷上的微生物群落分类和ARG多样性与人类口腔和环境微生物有关，并提示牙刷作为口腔微生物和环境微生物的交汇点，可能成为ARG转移的一个场所。该研究对于控制口腔来源的耐药菌群、减轻抗生素耐药对人体的危害具有重要参考意义。
原名：Toothbrush microbiomes feature a meeting ground forhuman oral and environmental microbiota
译名：牙刷微生物群是口腔微生物群与环境微生物群的交汇点
期刊：Microbiome
IF：11.607
发表时间：2021.1.31
通讯作者：Ryan A. Blaustein
通讯作者单位：美国西北大学土木与环境工程系，美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所
本项目通过Research Match（https://www.researchmatch.org）招募了参与者，对捐赠的牙刷进行微生物组分析，并收集研究对象的人口统计学、牙齿卫生、饮食等方面的元数据，同时使用REDCap在线完成个人信息调查。共收集到了34个带有相应元数据的牙刷样本。样品到达后在4°C下保存不超过24小时。使用无菌技术，用剪刀将已经处理过的牙刷头取下，然后放入无菌的50 mL锥形管中进行样品前处理。然后进行提取DNA的操作，使用Illumina HiSeq 4000平台进行测序。接着对宏基因组数据进行处理和分析，使用Quest上的Genomics Compute Cluster分析数据。使用Nonpareil v3.303评估了每个样本的基因组覆盖率。用MetaPhlAn2 v2.7.7确定了牙刷微生物群落的分类学组成和丰度，在属水平上，利用SourceTracker估计微生物区系的假定来源组分。我们训练贝叶斯模型测试了自来水和淋浴喷头以及人类相关的口腔、皮肤、阴道和肠道微生物组（HMP-II）的潜在来源，用ShortBRED v0.9.5确定了牙刷基因组的抗菌素耐药基因（ARG）图谱。然后，使用KBase对牙刷宏基因组进行了组装和装箱处理，在R v3.6.0中进行统计分析和数据可视化。使用Vegan v2.5-5计算微生物组多样性指标。通过方差分析和Tukey的事后分析确定基于样本类型-牙刷、人体部位、自来水、淋浴喷头和室内灰尘的微生物组Alpha多样性(Shannon指数)差异。采用Jaccard指数作为多样性指标，用主坐标分析(PCoA)和排列多元方差分析(PERMANOVA)对Beta多样性进行评价。同样的指标也被用来确定牙刷微生物群落和人类微生物群落假定来源之间的联系。然后，使用来自HMP-II的大小相等的子集（即每种样品类型n=34），将与牙刷相关的抗药性与人类口腔样本的抗药性进行了比较，使用Jaccard指数作为多样性指标，用主坐标分析(PCoA)和排列变异方差分析(PERMANOVA)评估牙刷耐药菌的多样性和牙刷微生物区系的假定来源之间的关系。所有参与者的元数据均从REDCap在线界面中提取，使用Mann-Whitney检验或Kruskal-Wallis检验评估了这些元数据与牙刷微生物组Alpha多样性（Shannon指数）之间的相关性。使用Jaccard指数作为多样性指标，用PCoA和PERMANOVA评估元数据与微生物群和耐药性Beta多样性的关系。
每个牙刷上的DNA鸟枪宏基因组测序获得（5.07±0.55）×106个质量读数，估计测序覆盖率为83.1±3.7％（n =34；平均值±标准误差）。牙刷微生物群主要来自口腔部位（图1a），其中包含与人类相关的类群。核心菌群(即>75%的样本)包括8种常见的口腔菌群（即链球菌Streptococcus、罗氏菌Rothia和韦荣球菌Veillonella成员）和另外两种可能与环境来源有关的菌群（即产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca和嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonasmaltophila）（图1b）。更广泛地说，存在37种相对保守的细菌（即至少50％的样本），其中81.1％是口腔微生物组中常见的细菌。
图1 牙刷微生物群的分类多样性反映了人类口腔微生物群的一个子集，受其他身体部位和建筑环境的影响较小。（a）牙刷微生物群的频率丰度；颜色强度对应于HMP-II口腔微生物组样品中检测的分类群频率。（b）不同样本类型中牙刷相关保守类群(即至少50%的牙刷样本)的检测频率。（c）PCoA显示牙刷、相关环境样品和人类微生物群的物种水平多样性。（d）每个样本类型的Alpha多样性(Shannon指数)。尽管牙刷与人类的微生物群落存在明显的重叠，但牙刷的微生物群落具有广泛的多样性（图1c）。牙刷样品中的群落组成和结构的差异（Jaccard距离= 0.708±0.029）大于人与人之间口腔微生物群落的变化（Jaccard距离= 0.563±0.003）（p <0.001；平均值±标准误差）。牙刷菌群与人类口腔（PERMANOVA R2 = 0.027）、阴道（PERMANOVA R2 = 0.062）、皮肤（PERMANOVA R2= 0.063）和肠道（PERMANOVA R2= 0.097）之间存在显着差异（p 值均<0.001）。牙刷菌群的Alpha多样性比皮肤和阴道更高，但低于口腔和肠道微生物群(图1d)。虽然约有一半的牙刷微生物群聚集在口腔微生物群中，但另一半与皮肤微生物群和其他微环境的菌群关系更为密切(图1c)。牙刷和室内灰尘都是微生物“水槽”，其中包含人类相关微生物群和环境微生物群的混合物。因此，牙刷上的菌群分类多样性与人类微生物群(主要是口腔)的类群比例有很强的关系(图2b;PERMANOVA R2= 0.215, p < 0.001)。牙刷组中的微生物群超过50%假定来自人类微生物群，其中包含的链球菌Streptococcus、罗氏菌Rothia、韦荣球菌Veillonella、放线菌Actinomyces和奈瑟菌Neisseria的相对丰度较高(图2c)。另外，牙刷组中关键生态群的微生物群较少，其中关键分类群包括克雷伯氏菌Klebsiella、不动杆菌Acinetobacter、窄食单胞菌Stenetrophomonas、假单胞菌Pseudomonas和肠杆菌Enterobacter (图2c)。总之，虽然牙刷包含独特的微生物群（PERMANOVA p <0.001），并且推测最常出现的菌群是从口腔中衍生的,它们的α多样性与建筑环境中发现的其他微生物群落最为相似。
图2 牙刷相关菌群来源于人类和环境类群的混合体。（a）SourceTracker预测的牙刷菌群的推定起源分布（属水平）。（b）PCoA在牙刷菌群中显示属水平的β多样性；（c）牙刷宏基因组中高丰度属的平均相对丰度(即> 2%的平均相对丰度)，以及假定来自人类微生物组的微生物群小于或大于50%的属。牙刷宏基因组和口腔宏基因组的子集（图3a）包含176个抗生素抗性基因（ARG）蛋白家族，后者包括人颊黏膜（n=11），角化牙龈（n=1），唾液（n=1），龈上菌斑（n=9）和舌头（n=12）口腔部位的样本。ARGs在药物类型和预测耐药性的机制方面各不相同。牙刷宏基因组中有158个ARG家系，每个样本有21.8±3.0个不同的家系，显著高于53个ARG家系和13.6±1.1个不同的家系(均数±标准误差;p = 0.042)。与微生物群分类谱不同，牙刷的ARG谱往往比口腔相关的同类更为多样化(图3b)。
图3 与口腔微生物组相比，牙刷的微生物组多样性更低，常见的抗生素耐药性基因(ARGs)也更少，但它们的耐药性更多样化。（a）所有HMP-II口腔样本分类谱的K-means聚类(n=1259;使用灰色点)生成与牙刷样本数量相等的质心(n = 34)。（b）Shannon指数用于口腔样本(橙色)和牙刷样本(红色)的总体生物分类和ARG特性。（c）保守菌种(即在至少50%的样品中检测到)的微生物菌种和抗生素ARG的重叠。牙刷耐药性比口腔相关菌种耐药性富含更多的ARG蛋白质家族(图4)，尽管较少部分表现守恒(即至少有50%的样本)(图3 c)且人与人之间的变异更多(牙刷Jaccard距离=0.794±0.034,口腔Jaccard距离=0.607±0.032,p <0.001)。对于所有保守的ARGs，每千碱基每百万的对数转换读数(RPKMs)在样本类型上没有显著差异(q> 0.05)(图4a)。
图4 牙刷耐药基因中的富集与环境衍生的牙刷微生物群落有关。（a）左:口腔(橙色)和牙刷(红色)样本中ARGs的检测频率>所有样本的10% (n = 68)。（b）基于ARGs归一化RPKMs的牙刷微生物多样性PCoA颜色强度表示从每个样本的人类微生物群推断得出的分类群的累积分数。（c）对于牙刷宏基因组中含有小于50%(灰色)或大于50%(橙色)的微生物群(假定来自人类微生物群)的富集在牙刷上耐药基因的对数转换归一化RPKMs(平均值±标准误差)。牙刷耐药基因的富集似乎最有可能是多样的的环境衍生类群导致。假设来自人类微生物组和替代来源的牙刷微生物组的ARG相关的β多样性显著相关(图4b;PERMANOVA R2= 0.141, p < 0.001)。与此一致的是，宏基因组组装发现了28个包含29个ARGs的类群，其中大部分属于生态位范围广的环境类群，如肠杆菌Enterobacter、克雷伯菌Klebsiella和假单胞菌Pseudomonas (Fig. 5)。
图5 含有ARGs的宏基因组组装基因组通常与环境相关类群有关。我们从参与者元数据中推断出可能影响牙刷微生物组结构和组成的多种因素（图6）。整个微生物群的β多样性是显著的，但与性别身份(PERMANOVA R2 =0.055, p=0.031)、牙齿缺失(PERMANOVA R2 =0.078, p = 0.004)和腺样体/扁桃体摘除(PERMANOVA R2 = 0.072, p = 0.010)具有微弱的相关性。
更广泛地讲，微生物分类学和ARG谱的α多样性似乎与口腔卫生之间的关系较弱（图7）。虽然使用牙线和漱口水的频率与分类的α多样性呈负相关的趋势，可能由于去除了潜在的微生物菌落，刷牙和使用牙线的频率增加与耐药α多样性呈正相关(图7)。除牙齿卫生外，微生物群的α多样性也与性别身份显着相关（p=0.045）。
图7 牙齿卫生可能与牙刷微生物分类(顶部行)和ARG(底部行)的多样性相关的趋势。关于特定微生物对假定的选择压力的具体反应，分级全对全显著性检验确定了与18个不同物种的相对丰度显着相关的12个变量（图8a）。我们发现，个人健康、牙齿卫生和环境变量的复杂组合可能会影响牙刷微生物群中的分类学多样性和抗菌素耐药性。
图8元数据与细菌种类的相对丰度之间存在显著的相关性（a）或者ARGs的RPKMs（b）在牙刷微生物群系基于分层的所有对抗所有关联(HAIIA)测试。牙刷是来自人类宿主和周围环境的微生物群的一个交汇点，牙刷微生物组中最突出的成员是口腔微生物组中常见的成员。一些保守的口腔相关类群，如放线菌Actimomyces、棒状杆菌Corynebacterium、嗜血杆菌Haemophilus、奈瑟菌Neisseria和链球菌Streptococcus，在生物膜附着和龈上菌斑的发育中发挥重要作用。生物膜形成的潜在机制可能对牙刷微环境的定植有影响。尽管与口腔微生物组（尤其是颊粘膜部位）存在广泛的菌群分类学重叠，但牙刷具有更多的异质性和更少的微生物群落。尽管分类学上的α多样性较低，但牙刷宏基因组所含的抗菌素耐药基因（ARG）比口腔的更多。尽管牙刷上大多数保守的微生物分类群是口腔微生物群的常见成员，但主要由假定为非人类来源的分类群组成，平均而言，富含牙刷的ARGs数量更多。宏基因组组合验证了大多数牙刷相关类群携带这样的ARG，其中，与以非生态位特异性微生物为主的微生物群落有关。牙刷可能带有一些类似的微生物菌落，尤其是考虑到ARG的富集反映了多种多药流出基因，并假定赋予了对三氯生的耐药性，即fabI和fabG。此外，由于大多数牙刷富含的ARGs仍然存在于主要包含人源类群的微生物群落中，尽管程度要比大多数由病例特异性或环境菌株组成的菌群少，其独特的牙刷耐药性可能与人类衍生的类群选择有关，而最适合在恶劣的建筑环境条件下生存。牙刷的微生物群与周围环境特征(如窗户的存在和打开的频率)之间的相关性与之前的研究结果一致，表明建筑设计对室内微生物群落的影响较小。尽管人们强烈希望使用“生物信息设计”来创造更健康的室内微生物群，而绝大多数情况下观察到的可能是死亡或代谢不活跃的室内微生物，很大一部分是由于缺乏水分。由于我们的探索性分析是基于相关性，没有控制可能驱动微生物组的变量，未来的研究需要更好地理解我们如何能够有针对性地设计/操作/使用建筑环境的不同组成部分，以促进研究微生物多样性、限制病原体和抗菌素耐药性的牙刷。由于我们的初步研究范围是确定牙刷的微生物组和潜在的驱动因素，因此限制包括相对较小的样本量（n=34）和缺乏配对的供体样本。较大的队列可能会改善本试验研究中发现的微弱但有潜在重要趋势的作用大小(例如，微生物组与口腔卫生习惯、牙齿缺失、腺样体/扁桃体切除、是否存在浴室窗户、牙刷存放位置等的关联)。毕竟，尽管室内微生物群落在很大程度上受到环境的影响，但这些特征通常与群落指标之间的关联很小或可以忽略不计。此外，由于微生物菌株的部位特异性和数据集之间可能存在混杂变量（例如，研究对象家庭实际水槽水与参考数据集中自来水的处理差异，测序中的批次效应），牙刷微生物群系与来自单独研究的人类相关环境和建筑环境对应物之间的比较是“高水平”的。但SourceTracker做出的人类分数预测表示，许多相同的微生物物种也存在于皮肤、阴道和肠道微生物区系中（例如链球菌Streptococcus和韦荣球菌Veillonella）。同样，牙刷上一些主要包含非人类来源的微生物群的突出分类群可能仍与人体部位相关，例如，肠杆菌Enterobacter或克雷伯氏菌Klebsiella的潜在肠道菌株。未来对牙刷和受试者的微生物群落进行监测的纵向研究，可能包含基因组水平的序列变体比较以进行跟踪，对于得出有关牙刷上的类群组装和潜在驱动因素的更强有力的结论至关重要。然而，考虑到与人类微生物群的区别可能指示为局部选择，牙刷微生物群似乎是抗菌素耐药性的一个重要储存库。该“水槽”是否会反过来成为在人类微生物组和室内环境中传播ARG的相关来源仍有待确定。
我们采用了宏基因组学的方法来定义从34个个体收集牙刷上的微生物群落和耐药性。通过将这些数据与之前的人类和建筑环境微生物组研究进行比较，我们发现牙刷上的微生物群落是由优势的口腔来源类群和更多功能的环境菌株组成的。尽管牙刷微生物群的多样性不如口腔微生物群，但它们具有关键基因富集（例如多药外排、三氯生抗性）的耐药性更强的菌群，这些耐药组似乎主要归因于非生态位特异性，可能是环境衍生的微生物群的部分。除其他因素外，牙齿卫生和浴室特征与牙刷微生物群系的关系较弱。总的来说，这些微生物群落的分类和ARG多样性反映了人类口腔微生物和环境微生物相遇的一个独特的库，这可能使ARG的转移成为可能。
