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Prevalence and mutational determinants of high tumor mutation burden in breast cancer高肿瘤突变负荷的乳腺癌患病率和突变决定因素

一、 研究背景

现在已经确定了免疫细胞上PD-L1的表达可以成为三阴乳腺癌中免疫治疗的预测生物标志物，但PD-L1因表达不稳定等原因在预测疗效上有一定的缺陷。这意味着需要找到更多的生物标志物，去预测ICI的疗效。已有文献表明免疫治疗对多种有高肿瘤突变负荷(TMB)的肿瘤类型有效，而TMB和PD-L1表达是对ICI反应的独立预测指标，在多个肿瘤之间的相关性较低。本研究的目的是评估高突变乳腺癌的频率、突变模式和基因组特征。

二、 分析流程

三、 结果解读

1.乳腺癌的高频突变

肿瘤突变负荷(TMB)就是肿瘤组织每兆碱基中突变的总数。作者先比较了六个队列中肿瘤突变情况，图1.A的小提琴图显示了每个数据集TMB的分布。虚线上方代表高频突变肿瘤。前三个数据集为全外显子组测序(WES)，其余数据集为目标序列捕获测序(panel sequencing)。图1.B柱状图显示的是3969个样本的TMB，可以看到，整个队列的中位TMB为2.63 mut/Mb，以10 mut/Mb的cut off为标准，5%(198例患者)的乳腺癌被认为是高突变。其中cut off=median (TMB) + 2 × IQR(四分间距)。图1.C中显示转移性肿瘤与原发肿瘤相比，有更高的中位TMB(P<2.2e-16)。

图1.3969例原发性和转移性乳腺癌的肿瘤突变负担(TMB)

作者还分析了不同组织学类型和分子分型的乳腺癌的中位TMB。组织学类型中无显著差异，但是在转移性样本中，转移性浸润性小叶癌(ILC)(17.0%)的高频突变比转移性浸润性导管癌(7.8%)显著富集(P <0.002)，因此作者提出了是否应该对所有ILC进行高突变检测的问题；分子分型中，与HR阳性(1.1 mut/Mb, P= 2.8×10-8)或HER2阳性(1.3 mut/Mb, P=0.003)相比，三阴乳腺癌(TNBC)的中位TMB显著升高(1.8 mut/Mb)。

2.高频突变乳腺癌有较高的溶细胞活性评分和较高的新抗原负担

因为高频突变会产生新的异常蛋白，能够产生与MHC高亲和力结合的新生抗原越多，免疫应答的可能性就会越高。作者先用157例MBCproject里(http://www.cbioportal.org/study/summary?id=brca_mbcproject_wagle_2017)的肿瘤标本获取了WES突变信息，然后用topiary(https://github.com/hammerlab/topiary)将来自WES的突变DNA序列通过计算翻译成相应的突变肽序列，接着用polysolver预测了特定患者的HLA分型，最后利用NetMHC 4.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)预测每条突变肽段与HLA的亲和力，结果表明与153个非高变肿瘤相比，4个高变肿瘤的新抗原负荷更高。

在这里，筛选新抗原突变肽的标准是：IC50≤500nM，percentile rank cutoff of ≤ 2.0。IC50 代表与50%的等位基因所编码的HLA抗原结合时的肽段浓度，单位为nM。该数值越小，表示肽段与该等位基因所编码的HLA抗原的亲和力越强。Rank(/%)代表亲和力相对百分排位，即肽段的IC50值在随机生成的400000条肽段的IC50数据集中的相对百分排位。数值越小，说明肽段与该HLA蛋白的亲和力处于相对越高的位置。

评估了新抗原负担的差异后，作者使用TCGA-BRCA数据集的RNA测序数据(N = 974)，评估了高突变是否与免疫溶细胞活性增强相关。因为较高的溶细胞活性评分有可能选择具有体细胞突变的肿瘤，使它们抵抗免疫攻击。而免疫细胞的溶细胞活性评分被定义为GZMA和PRF1基因表达值的几何平均值（RPKM），这里的GZMA和PRF1是CD8+T细胞的标志基因。结果观察到高突变肿瘤(N = 25)比非高突变肿瘤具有更高的溶细胞活性(P < 0.005)。

这些表明，高突变乳腺肿瘤可能有较高的新抗原负担，这可能导致T细胞浸润增加。

3.APOBEC是高频突变乳腺癌的主要突变过程

癌症的突变可能是由于内在的功能障碍（例如，DNA复制缺陷，DNA的酶修饰和DNA修复缺陷）或外在因素（例如，紫外线）引起的。这些突变过程会产生独特的突变类型模式，称为突变特征。已知有6种碱基突变类型(C>A, C>G, C>T, T>A, T>C, T>G)，还考虑到突变位点上下游的碱基，3个碱基组成的motif可以产生4X4X6=96种可能的突变亚型。作者用R中的maftools包(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/manuals/maftools/man/maftools.pdf)提取出4个突变特征，并与已知的30个与COSMIC signatures进行对比。图2.A 为206例高频突变患者（3969个样本中的198个高突变患者+8个Dana-Farber癌症中心患者的数据）的突变特征评分比例。浅绿色为APOBEC，APOBEC是一种胞嘧啶脱氨酶，它的失调与许多肿瘤有关;红色代表DNA错配修复缺陷(MMRd);蓝色代表同源重组缺陷(HRD);深绿色代表错义突变DNA聚合酶epsilon (POLE)特征。

图2.A 206例高频突变患者的突变特征评分比例

每个样本根据最大的Signature score确定该样本的显性突变特征。所以，由图2.A可得图2.B的四个突变特征的患者百分比。在这里，59.2%的患者具有显著的APOBEC特征。已知MMR缺陷是与高突变相关的重要机制，它也是唯一被批准作为ICI标记的高突变表型。但是作者发现，尽管这些高突变肿瘤中有36.4％具有显性MMRd特征，但大多数（59.2％）具有显著的APOBEC突变特征。这表明如果我们仅关注MMRd或微卫星不稳定性(MSI)的标志物，可能会错过大多数高突变乳腺肿瘤，从而影响患者的治疗。

图2.B 四个突变特征的患者百分比

图2.C是肿瘤突变负担(TMB) 在四个突变特征上的分布。中位TMB在APOBEC和HRD的样本中较高。

图2.C 肿瘤突变负担在四个突变特征上的分布

3.带有和不带有APOBEC显性突变特征的高频突变乳腺癌的基因组“景观”

确定APOBEC显性突变特征是该样本中高TMB的主要突变特征后，作者尝试找到与APOBEC突变相关的基因。图2.D的火山图，表示每个基因的突变率差异和显著性(-lg p-value，经Fisher的精确检验计算)的关系，作者已使用使用R中p.adjust()函数和错误发现率方法进行多次检验校正。绿点(左边)是高频突变肿瘤中带有APOBEC显性突变特征比不带有该特征的突变率高的基因，结果表明PIK3CA在APOBEC显性高突变肿瘤中显著富集。

图2.D 基因的突变率差异和显著性关系

图2.E显示了PIK3CA螺旋区域的突变比例在具有显性的APOBEC特征的高突变肿瘤中显著富集(p=0.01)；在没有显性APOBEC的高突变肿瘤中，激酶结构域的突变富集（但p值无统计学意义）。这里与其他研究一致，作者发现APOBEC诱变与PIK3CA突变之间的关系，尤其是与螺旋域中的突变之间的关系。且已有报道，PIK3CA突变与微卫星稳定实体肿瘤中ICI的完全或部分应答有关。

图2.E APOBEC特征与PIK3CA突变之间的关系

4.抗pd -1/PD-L1治疗高频突变乳腺癌的疗效

先前的研究已经证实了高频突变和对免疫检查点的应答之间的相关性，然而，前面提到MMRd是唯一一个被批准作为ICI标志物的高突变表型，所以作者假设高突变的乳腺癌对ICI的反应可能与潜在的突变过程无关。为了验证这一点,作者调查了222名MBC project患者的治疗史，这些患者来自DFCI的前瞻性转移活检队列。确定有8名高突变乳腺癌患者(3.6%)，其中4名已经接受了基于抗PD-1/PD-L1的治疗。值得注意的是，其中3例患者对治疗效果达到了理想应答，并延长了无进展间期(图3)。第四例患者在开始使用抗pd -1抗体治疗2周后死亡，因此无法评估其对治疗的反应。对三个有理想应答的患者转移性活检的突变特征分析显示，两个患者的显性突变特征为APOBEC，第三个患者为MMRd。这里证明了即使突变特征不是MMRd，ICI治疗也可以得到理想的应答。

图3.转移性晚期乳腺癌患者接受pembrolizumab-based治疗的细节

小结

本篇文章中通过研究表明，5%的乳腺癌具有高TMB，且转移瘤中有富集。这些肿瘤与较高的新抗原负荷和T细胞浸润增加有关。在高TMB乳腺癌患者中存在不同的突变特征，其中APOBEC活性的特征是最常见的。初步数据表明，高突变的乳腺癌可能受益于ICI，而与潜在的突变过程无关。

值得一提的是尽管尚不知道TMB在实体瘤中作为ICI预测生物标志物的临床用途，但在非小细胞肺癌中，APOBEC已经适用于免疫治疗患者的标志，而APOBEC是高频突变乳腺癌的主要突变过程，这提示或许TMB能成为预测ICI治疗乳腺癌的标志物。