文献解读 | 圆环RNA crf 4作为癌基因，调节ml-af4融合蛋白的表达，抑制mll-af4融合蛋白的表达，MLL白血病进展
论文：circRNA circAF4 functions as an oncogene to regulate MLL-AF4 fusion protein expression and inhibit MLL leukemia progression（圆环RNA crf 4作为癌基因，调节ml-af4融合蛋白的表达，抑制mll-af4融合蛋白的表达，MLL白血病进展）
摘要
CircRNAs是新发现的ncRNA，在各种生物过程中起着重要作用。包括癌症的发生和发展。圆环RNA是高度稳定的，因为它们的圆形形式，缺乏任何开放的末端，有效地抵抗由外核酶引起的降解。
据报道，圆环RNA优先定位于细胞质，并在细胞质中发挥作用，它们可以作为microRNAs(MiRNAs)海绵来影响翻译过程，或直接与蛋白质结合以调节蛋白质的定位和功能。
一个例子是crna CDR 1包含miR-7的多个保守结合位点，并调控其下游基因的表达。另一个例子是CircRNA_100290，它在口腔鳞状细胞癌中高表达，并通过与miR-29家族成员的结合调节CDK 6的表达。
在白血病中，虽然在基因易位过程中发现了来自融合区的cRNA，称为f-cRNA，但只有少数报道。例如，只有一个圆环RNA，名为f-圆环M9，据报道是从MLL-AF9白血病基因。
然而，在MLL-重新排列的白血病MLL基因可以与100多个伴侣中的一个进行融合，包括AF4, AF9，和烯醇，形成100多个MLL融合基因。
我们怀疑crna是否也起源于合作伙伴MLL易位以及伴侣形成的圆环RNA是否对融合基因和白血病细胞活性也有影响。
人白血病细胞圆环AF4的鉴定与鉴定MLL-AF4易位
a.4种圆环RNA基因座的原理图AF4基因。箭头代表指示的圆环RNA的长度。
b.采用不同引物对圆环RNA进行验证。
c.从人白血病细胞株RS4；11中分离到RNA。用qtr-PCR方法验证了4种圆环AF4亚型的表达。表达式是使用2计算的。−ΔΔCT方法，并归一化为GAPDH。
d.用Sanger测序法验证了圆环AF4的qtr-PCR产物。箭头表示圆环AF4独特的连接位置。
e.QRT-PCR法检测RNase R处理细胞内crcAF 4和GAPDH mRNA的丰度，并将crcAF 4和GAPDH mRNA的含量与模拟处理的量进行归一化。
f.加入2μg ml可阻断转录。−1放线菌素D至RS4；11细胞培养基。在指定的时间点提取RNA。Qtr-PCR分析如下所述。NS，没什么意义。*P < 0.05, ***P < 0.001.
g.应用qtr-PCR技术对白血病患者和正常人crcAF 4的相对表达进行了分析。NS，没什么意义。*P < 0.05, ***P < 0.001
CircAF 4在MLL-AF4白血病
接下来，我们研究了在以下情况下是否需要更高水平的ccaf 4来维持增殖和抑制细胞死亡。MLL-AF4重新排列。两个B细胞全细胞系，RS4；11和SupB 15，有或没有MLL-AF4融合基因分别用于以下研究。
如图所示，我们使用了两种小干扰RNA(si-CircAF4)，专门针对圆环AF4的背剪接连接点。2A可降低crcAF 4的表达水平。以非特异性siRNA序列作为对照。
观察到siRNAs直接针对环状转录体的反向剪接序列的特异性，这两种siRNA只破坏了循环转录本，不影响线性种的表达(图1)。2b和c)。然后进行CCK 8细胞增殖试验。
如图所示。2CrcAF 4的下调对RS4细胞的生长有明显的抑制作用，但对SupB 15细胞的作用有限(图1)。2e)。Edu掺入法和细胞周期分析法进一步证实，干扰crcf 4表达时，rs4；11细胞的增殖受到抑制(附加文件)。1*图S1c和d)。
此外，我们还测定了crcAF 4基因敲除后的细胞凋亡率，结果表明RS4；11细胞中存在凋亡。2(F)而对SupB 15细胞无影响(见图)。2g)。总之，它可以暗示crcaf 4在白血病中起癌基因的作用。MLL-AF4易位。
CircAF 4促进体内白细胞生成
aQRT-PCR证实慢病毒在RS4；11细胞中敲除圆环AF4。数据由三个实验的平均±扫描电镜显示。***P < 0.001.
b人RS4-11细胞与sh-NC和sh-CircAF 4共转染小鼠骨髓标本赖特-吉姆萨染色的细胞引脚。小鼠GFP+细胞由黑箭头指示。
c对照组和RS4-11小鼠脾脏的典型照片。经sh-CircAF 4处理的小鼠脾脏大小和体重明显降低(n=3)。*P < 0.05.
d苏木精和伊红染色显示，与对照小鼠相比，RS4-11移植小鼠的指示器官中存在白血病细胞浸润。组织中的GFP+细胞用黑色箭头表示。在×40物镜下观察染色情况。疤痕条，50μm。
e流式细胞仪结果显示gfp水平显著下降。+血液和骨髓标本中的细胞形成与对照组相比，crcAF4基因敲除RS4-11细胞的小鼠。这些作用伴随着降低小鼠脾脏的爆炸浸润。**P < 0.01 and ***P < 0.001.
f用sh-nc和sh-CircAF 4处理RS4-11细胞后，NOD-SCID小鼠的Kaplan-Meier存活曲线n=每组5只)。P数值计算采用对数秩(mantel-cox)检验。
讨论
已经发现，在体外和体内治疗中，融合圆环RNA可以提高细胞增殖率，为肿瘤细胞提供生存优势。但从融合区中只能产生少量的f-圆环RNA。核聚变区域产生的f-圆环m9就是一个例子。
MLL-AF9基因在白血病中的作用MLL-重新排列的白血病MLL基因可以与100多个伴侣中的一个进行融合，包括AF4, AF9，和烯醇，形成100多个MLL融合基因。
因此，我们分析了六种最常见的MLL重新安排，包括MLL-AF4, MLL-烯醇, MLL-AF9, MLL-AF6, MLL-AF10，和MLL-Gas7，约占总数的60%。MLL易位白血病。
结果表明，大量的转录因子可能来源于这些伙伴，提示融合基因伴侣来源的crcRNAs(我们将其命名为FP-CircRNAs)作为白血病染色体易位的治疗靶点具有潜在的潜力。
在基因易位过程中，为了研究来自不同融合伙伴的其他FP-cRNA，以及形成的转录因子是否对融合基因和癌细胞活性有影响，还需要进一步的研究。
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