核酸快检利器：分子恒温扩增技术！
扫码文末二维码即可加入
罗辑医疗知识星球3000+医健精英关注的知识社群
最近某大CEO一篇关于雅培快检的文章迅速串红，由于文章的主旨是其一贯的风格‘国货当自强’，借助情怀吸引眼球，并一时间被众多自媒体嗨转，但是如果细观其文你会发现，文章就是一个典型的屁股文，先是拿着产品的protocol骂了一通，其大意是这个外佬技术员还敢自吹营销宣传快检5分钟，老汪家隔壁实验员比你们牛×，可以分分钟灭了你，然后用两个花式计算论证这款产品灵敏度太低，结论就是：即不快也不准，相信哪天我族民智大开，民族自信心起来了，相信凭借俺的神功，可以一嘴口炮炮轰美利坚，等着吧，小样的米国！（哈哈，段子勿笑，言归正传还是看正文）
上月27日，美国雅培（Abbott）公司在其官网表示，雅培的诊断测试已获得美国FDA的紧急使用授权（EUA），该产品是用于检测新型冠状病毒（COVID-19）的最快的即时分子诊断测试，可在短短5分钟内产生阳性结果，在13分钟内产生阴性结果。
这个月，雅培将提高生产量，每天为美国医疗系统提供50,000 ID NOW COVID-19测试。雅培表示，先前批准的 Abbot m2000 RealTime SARS-CoV-2 EUA测试运行在另一个系统 m2000 RealTime System 上，用于集中式实验室环境。结合ID NOW™，雅培预计在4月份进行约500万次测试。那这款特朗普力推的检测试剂的原理是什么呢，就是大名鼎鼎的以RNA分子为模板的恒温扩增技术！
也许每个人第一次看到这个技术的时候，简直可以用“震惊”、“惊艳”来形容。扩增速度真快啊，十几分钟就能出结果，比现在吭哧吭哧做PCR岂不是方便多了！可是国内几年过去了，似乎也没看到多少基于恒温扩增技术的临床产品上市。说真的是有点失望的。上面这幅市场应用图（如上）可以非常直观的反应国内外这种技术的应用差距，在传染病领域，美国的RNA恒温扩增技术生产的试剂盒已经占到了64%的市场份额，同比国内还是零，国内基本上还是完全依赖于传统的筛查技术。
恒温扩增技术与PCR技术原理比较（仅供参考）
何为RNA恒温扩增技术，顾名思义，就是可以直接以RNA为模板（很重要，驳某大CEO文章会提及，原文大言不惭提到拷贝数，说人家灵敏度不够），在恒定的温度下进行扩增的技术，可以实现快速直接对病原微生物的检测，相比于传统的PCR，具有检测时间快，灵敏度高，容易实现自动化操作门槛低，价格成本低，避免交叉污染，检测对象为活体的诸多优点！
某大CEO文中，自称用两种方法得出：各种等温扩增技术的LOD极限大概在CT值35左右，是RT-PCR的1/5-1/10的灵敏度。如果产品优化的不好，可能只有1/100左右。NEAR作为一种等温技术，理论上也应该与此相当，结合其流感的检测数据（CT＞31就明显降低），其LOD预计只有RT-PCR的1/20-1/40左右，进一步结合该PCR产品的理论LOD100-200copies/ml，可以计算出ID NOW的可能灵敏度在2000-8000copies/ml。
姑且认为上述花式换算准确无误，但是他们忽略了一个事实，RNA恒温扩增技术中是以RNA为初始模板，在病原微生物中RNA的初始模板拷贝数是DNA模板拷贝数的数百倍以上，即RNA 拷贝数>DNA拷贝数（10的4次方 >1），即使其LOD的拷贝数只有PCR的1/40，其结果准确率仍然应该不低于RT-PCR。
因为以RNA为起始模板，这就是为什么分子恒温扩增方法灵敏度高的原因，一般能检测到普通PCR的1/10~1/100的拷贝数！这本来是稍微知道这种方法学人的基本常识，明明恒温技术灵敏度和反应时间上，并不输给PCR。不知道为何他们要故作高深用两种计算方法来驳倒一种常识，真是贻笑大方！
友情提示：
目前，PCR技术的检测下限一般在500～1000拷贝数/毫升，这意味着每20微升的样本（大概一滴血的量）中至少要包含10-20个新冠病毒核酸分子，PCR技术才能发现病毒的踪迹，如果病毒核酸低于检测下限就会产生假阴性。
其实有一种解释，他们可能就没有弄懂恒温扩增技术的核心原理，实在的说这也情有可原，毕竟这个技术在国内的认知程度不高，包括很多科班出身的人由于都是接受传统的PCR扩增技术训练，很容易形成思维惯性，他们甚至很好奇不用变性退火延伸如何进行扩增，小编在写这篇文章之前也是这种状态，但是不懂没关系，我们可以重新去认知和学习，不要有屁股思维，为了卖你家的产品就如此大力低贬低别人家产品，华大智造叫板CDC的利弊分析，臭棋还是妙棋？华大公开叫板中国疾控中心伸张正义，难道它就是传说中的圣母？不信可以看看，这是他们的一贯套路，还是那句话，千万别信他们的动机有多么的白莲花，以为是爱国图强，其实他们是商人，看清楚这点本质就好，他们所有的包装，公益义演也罢，科普达人也罢都是最终服务于他们自家的产品！
等温扩增技术流派分析
等温扩增技术按照扩增目的可以划分为特异性扩增和非特异性扩增两类。特异性扩增技术按其技术流派包括Recombinase polymerase amplification (RPA）,Nicking enzyme amplification（NEAR），中文翻译为“切口酶扩增反应”，也被成为“指数扩增反应”（就是本文主角雅培ID NOW COVID-19的技术原理），还有Nucleic acid sequence-based amplification(NASBA), TMDA , Rolling circle amplification(RCA)以及Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)等等众多流派！（以下内容整理出处为知乎达人胡汉三）
TwistDx公司的RPA技术（已被雅培收购）
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），具体原理不再介绍。2006年发明，到目前为止尚未开发出成熟的临床应用系列产品，主要用于科研，涉及的领域，病原体检测、动植物检测都有。
官网下摘录的中文介绍
RPA 非常快速，在 37-42°C 这一通常最适宜的反应温度下，只需少量核酸分子即可在 3-10 分钟(通常)内扩增至可检出水平，但这将取决于靶标大小。在大部分情况下，只需要一个人即可在半小时内采集样本、制备样本、运行检测并取得结果，并且无需专业培训。
RPA专利是属于 Dr. Niall Armes 联合 Dr. Derek Stemple 和 Dr. Nagesh Mahanthappa 创办的 TwistDx Inc。公司最早成立于麻省的剑桥，之后2002年在英国剑桥成立 TwistDx Limited。TwistDx于2010年被Alere收购。之后在2017年雅培通过收购Alere获得可RPA技术的专利。
Ionian Technologies Inc.公司的NEAR技术（已被雅培收购）
NEAR是 Ionian Technologies Inc. 的技术，是基于NEAR(Nicking enzyme amplification reaction，切口酶扩增反应技术)。Ionian是加州的初创公司，成立于2000年，和上面成立于麻省剑桥的TwistDx Inc. 很接近，两者又都在2010年被Alere收购。而后Alere在2017年被雅培收购，NEAR和RPA技术都成为雅培的专利。两者的路线发展时间线比较相近，Nicking Enzyme 或者叫 Nicking endonuclease, 中文名叫切口酶或者缺口酶 。与常见的核酸内切酶不同的是，切口酶识别特定序列以后只切开一条链。从病毒核酸序列上切下特定短序列(8-16个碱基)的单链以后，利用恒温扩增的DNA聚合酶（isothermal amplification chemistry 专利中未具体描述）。又因为温度保持在60℃左右，合成的短序列自动解旋成为两个单链，于是这两个单链又分别作为恒温扩增酶的模板进一步扩增。在短时间内，只要原料和能量充足，这个扩增反应是指数速率的。而且由于不需要经过升温和降温的过程，相比传统的PCR过程，速度上的优势是肉眼可见的。新合成的短序列单链之后与带有荧光的引物结合，从而通过荧光来定量分析。当荧光达到一定强度，认定相应的病毒DNA达到一定含量，认定为阳性。ID NOW设定的阈值是5分钟观察，5分钟如果达到阈值，则报告为阳性；如果5分钟未达到，则继续观察，在13分钟前达到阈值，也报告为阳性；13分钟时仍未到达阈值的，报告为阴性。这个技术相比其他的核酸检测方法，优势在于速度和灵敏度（初始只需要数百个病毒拷贝）；缺点在于短序列的设计存在高假阳性的可能。
最后用我们网红医生张文宏主任的一段话做结！
张文宏医生：“之所以成为世界上医疗体系最强大的国家，就是因为它有着世界顶尖的医疗技术。举个简单例子，美国12天已经更新了6代病毒的检测试剂。最初的检测时间是2天，然后缩短为1天，又缩短为6小时。之后又减少到3.5小时和1.5小时，现在的检测只需要5分钟，而且准确率都超过95%。“