测量前还是想再交待一下，所有需要进行半定量分析的图像，一定要控制原始图像的质量。一方面要精细地完成染色过程，背景荧光是引起测量误差的最大原因；另一方面，采集图像的过程也是很重要的。（要点见文末链接）本文主要在于操作，以下图为例，测量胞浆蛋白（红色）；测量软件为Image J。
1. 由上图可以看到，被测量的图像为红色通道+DAPI形式，比较简单；而且背景很弱，说明染色效果较好，抗体特异性高。
测量思路：分割两个通道的图像，然后将红色通道荧光图像转换为8 bit 黑白图像；接下来在一定阈值下，测量平均灰度值，以此代表平均荧光强度。
2. 打开Image J，打开测量图像。然后点击Image，选择Color，选择Split Channels，分割通道。
3. 操作后，原始图像会分成红、绿、蓝三个通道的8bit 黑白图像。这里我们要测量红色通道下平均荧光强度，因此，选择red即可。另外两张图像可以直接关掉。
4. 接着点击Image，选择Adjust，选择Threshhold。这一步是手动选择阈值。
在弹窗的窗口中，如下设置，默认选择Default分割模式，选择Red，一定要勾选Dark background。
原则：保证所有的目标区域都被红色覆盖选中。
5. 还有一种阈值模式，自动阈值法，即形成所有分割模式下的图像，自行选择最佳分割效果即可，分割原则同上第四条。点击Image，选择Adjust，选择Auto Threshhold，Try all模式下继续点击OK，得到如下形式。
6. 设置测量参数。选择Analyze，然后选择Set Measurements，如下勾选。记住，一定要选择Limit to threshold，这样测量的才是被选择的目标区域，否则软件会默认计算全图。 点击OK。
7. 按Ctrl+M快捷键，调出结果窗口，如下。其中Mean就是平均灰度值，也代表着这张图像上红色荧光的平均荧光强度。
如果你要测量积分灰度值，那么在参数窗口选择Integrated density。结果窗口的IntDen就是结果。简单算一下就能看出，Area × Mean = IntDen。
大家可以参考下方文章，优化结果。如果想进一步了解免疫荧光测量的注意事项，可用点赞的形式表达意愿，我会根据情况，单独出一篇。
