新思路！尿液转录组标志物发6分+SCI！ / 开普饭

The Urinary Transcriptome as a Source of Biomarkers for Prostate Cancer泌尿转录组作为前列腺癌的生物标志物的来源

一、研究背景

PCa是全球男性中第二大最常见的癌症，也是男性癌症死亡的第五大主要原因。通常，PCa生长缓慢，高达40％的确诊男性没有任何临床症状。但是，如果在早期（即局部）诊断出PCa，则患者的五年生存率> 99％，但是如果在晚期、高级别转移性诊断，则仅有不到30％的生存率。因此，早期诊断PCa筛查有可能从根本上改善这种癌症的医疗负担。

尿液是PCa筛查的一种特别有吸引力的生物标志物的来源，因为与血液相比，尿液检测更容易，并且可能在早期阶段发现疾病。多项研究表明，尿液包含许多不同种类的RNA，包括mRNA ，miRNA和其他非编码RNA 。

二、研究流程

三、结果解读

1. PCa患者尿液循环转录组

表1. 研究中使用的不同队列

由于从尿液中获得的cfRNA量少（尿的平均产量为45 ng / mL），作者根据是否被诊断为BPH，LS PCa（即Ⅰ/Ⅱ/期）或HS PCa（即Ⅲ/Ⅳ期），将五个样本汇总起来。表1中给出了各个患者的详细信息。紧接着作者使用纯化的总RNA来构建Truseq文库，并按照材料中的说明使用Illumina HiSeq测序仪对文库进行高通量测序。

补充图4.收集的RNA样品的高通量测序结果汇总 > 20

作者每个样本平均获得1190万次reads（范围为11.3~12.7），并且至少有81％的reads通过了质量控制（QC）过滤（Phred分数> 20）（补充图4），大约51％至75％的reads被映射到人类基因组（HS19），并且在样品中检测到46964个不同注释转录本（每个转录本> 10个reads）。其中，在样品中检测到316种不同的miRNA，分别占BPH，LS和HS样品中映射reads总数的2.2％，1.2％和2.7％。最普遍表达的miRNA是miR-663a，miR-663b，miR-1977，miR-30c，miR-181d和miR-29c。

补充图5. 按平均测序reads计数的top 50的转录本

在BPH，LS和HS样本中，前50个转录本（按平均测序reads计数）分别占总reads的35％，16％和29％（补充图5）。该列表主要包含mRNA蛋白编码的转录本（37/50），其中大部分是线粒体编码的转录本（15/50），和MUC（粘蛋白）家族的五个成员。共有13个ncRNA转录本，包括信号识别颗粒RNA（RNA7SL）的4个成员，2个lncRNA（AC010970.2和AC079949.1），1个miRNA（miR-663），1个YRNA（RNY4）和1个snoRNA（snoU13）。

图1 差异表达基因的Venn图显示不同分组之间存在重叠

（BPH vs.LS）和（BPH vs.HS）之间共有12份转录本，（BPH vs.HS）和（LS vs.HS）之间共有9份转录本，（BPH vs.LS）和(LS vs.HS)之间共有65份常见转录本（图1）。对BPH和LS（n = 327），BPH和HS（n = 63），HS和LS（n = 341）之间差异表达的转录本进行的本体通路分析，显示出分别有12、4和21条通路的显著富集。

2. 离心和非离心尿液队列的验证

图2.在独立的CU和NCU样品验证队列中，通过液滴数字（DD）PCR测定的mRNA表达水平（拷贝数/ µL）

作者设计了 Taqman 探针来检测五个差异表达的基因片段，并在从 73 名 PCa 患者和 21 名年龄匹配的健康对照中收集的 CU 的单个样本（非池样本）中，通过液滴数字(DD)PCR 测量它们的水平，此外还有来自 60 名 PCa 患者和 24 名年龄匹配的健康对照的个体 NCU 样本。作者使用独立t检验比较表达水平（* p≤0.05；** p≤0.01；*** p≤0.001）。

3. ROC分析选定mRNA生物标志物

表2. 选定的mRNA生物标志物的ROC分析

图3.在 NCU 样品中，mRNA 的表达水平(拷贝/μL)根据 D‘Amico 评分按风险组分类。用独立 t 检验比较表达水平(*p<0.05；*p<0.01)。

为了研究尿液样本中基因片段的生物标志物潜力，作者进行了ROC分析，比较了单个基因区分 PCa 和 / 或 BPH 样本与对照样本的能力（表2）。作者还使用Panelomix算法将基因组合在一个Panel中。筛选BPH和对照CU样品的最佳预成形基因是PHC3和FTH1，AUC值为0.782。相同的基因也被证明是CU-BPH样品与CU-HS或CU-PCa（即LS和HS样品）之间的最佳鉴别基因，AUC值分别为0.771和0.711。有趣的是，尽管FTH1在ROC分析中并非总是具有最高AUC值的基因，它总是包含在优化的Panel设计中，即使是在NCU样品中。

为了研究这些基因作为预测性生物标记，作者还根据D'Amico评分分析了它们在低、中、高风险组之间的表达。作者仅分析了NCU样本，因为CU队列患者均被定义为高风险。在 NCU 样本中，BRPF1、 OSBP、PHC3 和 UACA 的水平在比较高风险、低风险和中等风险患者时表现出显著差异（图 3）。此外，根据Gleason评分对患者进行分类，对基因进行了分析在NCU样本中，作者没有发现Gleason组之间存在任何显著差异，但在 BRPF1 水平上确实发现了 Gleason>7（中间侵袭性）和 Gleason>8（高侵袭性）病例之间的差异。相反，在 Gleason<6（攻击性差）和 Gleason>8病例中，OSBP 和 PHC3 的水平有显著差异。

小结

作者通过解释BPH和PCa患者的整个尿液转录组，鉴定并独立验证了DDRT-PCR在1 mL离心或非离心尿液中可检测到的5种mRNA生物标志物。虽然很明显需要进一步验证，但这项研究表明尿液是一种生物标志物的宝贵来源，肯定值得进一步探索。

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