高度免疫缺陷小鼠模型(NPG 小鼠)构建技术服务
1.基本信息
(1)品系名称：NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst
(2)常用名：NPG小鼠
(3)背景：NOD
(4)毛色：白色
(5) 品系建立：NPG小鼠
2.制作简介
首先构建了Il2rg基因打靶载体，在B6/129 F1背景的ES细胞上，筛选得到将Il2rg基因敲除的阳性打靶细胞（见图1）。通过囊胚注射的方法，获得了Il2rg基因敲除的ES嵌合小鼠。然后，将ES打靶小鼠，与NOD-scid小鼠回交，从后代中选择Il2rg因基敲除鼠，再与NOD-scid小鼠回交。通过12代的回交，获得并选择Il2rg-雄鼠和Il2rg+/-雌鼠交配，获得PrkdcscidIl2rg-/-小鼠。随后，NOD.PrkdcscidIl2rg-/- 小鼠按照近交系的方式扩繁生产。
图1. Il2rg 基因打靶策略示意图
3.质控检测和表型分析
NPG小鼠主要包括两个基因突变，（1）Prkdc基因的点突变，在84号外显子上，TAT→TAA，产生了一个无效的包含83AA的删短蛋白；（2）Il2rg基因小鼠，3-8外显子的编码区被删除。NPG小鼠的SNP分析结果见表1，与NOD-scid (NOD.CB17- Prkdcscid/NcrCrlVr)小鼠一致。
表1. NPG 和NOD-scid 小鼠SNP分析结果。
|
SNP ID |
Chr-cM |
Allele |
NPG |
NOD-scid |
|
|
1 |
RS8253473-SNP1 |
1-80 |
V=A, F=C |
F F |
F F |
|
2 |
RS13476104-SNP1 |
1-128 |
V=C, F=T |
V V |
V V |
|
3 |
RS13476435-SNP1 |
2-35 |
V=A, F=T |
F F |
F F |
|
4 |
RS13476730-SNP1 |
2-119 |
V=A, F=T |
V V |
V V |
|
5 |
RS13477470-SNP1 |
3-146 |
V=A, F=G |
V V |
V V |
|
6 |
RS13478001-SNP1 |
4-135 |
V=C, F=T |
V V |
V V |
|
7 |
RS13478215-SNP1 |
5-42 |
V=A, F=C |
F F |
F F |
|
8 |
RS13459087-SNP1 |
5-86 |
V=A, F=G |
F F |
F F |
|
9 |
RS13478818-SNP1 |
6-73 |
V=C, F=G |
F F |
F F |
|
10 |
RS3710839-SNP1 |
6-121 |
V=A, F=G |
V V |
V V |
|
11 |
RS3666902-SNP1 |
7-15 |
V=T, F=C |
VV |
VV |
|
12 |
RS8260975-SNP1 |
7-34 |
V=A, F=C |
V V |
V V |
|
13 |
RS13479791-SNP1 |
8-60 |
V=A, F=G |
F F |
F F |
|
14 |
RS4227276-SNP1 |
8-80 |
V=C, F=T |
F F |
F F |
|
15 |
RS8254841-SNP1 |
9-38 |
V=A, F=T |
F F |
F F |
|
16 |
RS13480385-SNP1 |
9-103 |
V=C, F=T |
V V |
V V |
|
17 |
RS13480546-SNP1 |
10-24 |
V=C, F=T |
F F |
F F |
|
18 |
RS13480803-SNP1 |
10-123 |
V=C, F=T |
V V |
V V |
|
19 |
RS13480933-SNP1 |
11-25 |
V=C, F=G |
V V |
V V |
|
20 |
RS3653651-SNP1 |
11-102 |
V=C, F=T |
F F |
F F |
|
21 |
RS13481624-SNP1 |
12-99 |
V=C, F=G |
F F |
F F |
|
22 |
RS13481852-SNP1 |
13-63 |
V=A, F=C |
V V |
V V |
|
23 |
RS13482131-SNP1 |
14-30 |
V=C, F=T |
V V |
V V |
|
24 |
RS13459176-SNP1 |
15-3 |
V=A, F=C |
V V |
V V |
|
25 |
RS4170048-SNP1 |
16-32 |
V=C, F=G |
V V |
V V |
|
26 |
RS13482843-SNP1 |
17-4 |
V=C, F=T |
V V |
V V |
|
27 |
RS13483295-SNP1 |
18-35 |
V=G, F=T |
V V |
V V |
|
28 |
RS13483601-SNP1 |
19-34 |
V=A, F=G |
F F |
F F |
|
29 |
RS13483739-SNP1 |
X-40 |
V=C, F=T |
V V |
V V |
|
30 |
RS13483962-SNP1 |
X-109 |
V=A, F=C |
F F |
F F |
NOD(non-obese diabetes) 背景适宜人源细胞移植[13]；Prkdc基因突变，小鼠T、B细胞缺失[14,15]；Il2rg蛋白的gamma链被敲除，其NK细胞活力几乎丧失[16,17]。因而其基因检测和表型分析主要集中在4个方面：①NOD背景（SNP检测）；②Prkdc点突变（PCR检测；T、B细胞缺失的流式检测）；③Il2rg敲除（PCR检测，功能性NK细胞缺失的流式检测）；④细胞移植重建分析。
(1) NOD背景检测
NPG小鼠制作使用的NOD-scid小鼠，其遗传检测数据见右上30个SNP(single nucleotide polymorphism)位点信息表，这些位点遗传标记分布于20条染色体。
(2) Prkdc点突变、Il2rg敲除和NOD背景（Sirpa基因）检测
Prkdc点突变小鼠， 1983年由福克斯蔡斯癌症中心（Fox Chase Cancer Centre）的Bosma等人发现[14,15]。Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的T和B细胞缺失 ，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。Il2rg敲除小鼠表现为胸腺发育不全，NK细胞数量减少，活性丧失[16,17]。目前Prkdc点突变常用的检测方法为PCR检测；蛋白水平的检测比较方便的是流式分析其外周血中T、B淋巴细胞的含量。Il2rg敲除常用的检测方法为PCR检测；蛋白水平的检测比较方便的是流式分析其脾脏中NK细胞的含量和活性。NPG小鼠采用上述方法进行质控，结果见下图。
图2 Prkdc基因PCR检测 图3 Il2rg基因PCR检测
图4 NOD背景（Sirpa基因）检测
(3) T、B和NK细胞检测
图5 NPG小鼠缺失有功能的T、B和NK细胞。流式分析B6, Balb/c nude和NPG小鼠外周血中CD3+ CD4+ or CD3+CD8+ T 细胞 , B220+ B 细胞和NKp46+ NK 细胞的含量。
(4) 造血干细胞移植重建和肿瘤细胞移植数据
① NPG小鼠移植人造血干细胞效果显著优于NOD-scid小鼠。
图6 NPG和NOD-scid小鼠移植人造血干细胞，第12周时人CD45+细胞嵌合率分析。左图为移植后12周时外周血中人CD45+细胞比例的流式分析结果；右图为骨髓中人CD45+细胞的比例。
②人造血干细胞（HSCs）移植NPG小鼠高水平重建造血系统
图7 NPG小鼠移植人造血干细胞（HSCs）后，可以高水平重建造血系统。左图为将 5×104脐带血CD34+细胞通过骨髓移植入6-8周的NPG小鼠后检测结果; 右图为1×105脐带血CD34+细胞移植后16周在NPG小鼠脾脏中检测到高水平的人CD45+细胞
③人造血干细胞（HSCs）移植NPG小鼠后重建各系造血细胞比例检测
图8人造血干细胞（HSCs）移植NPG小鼠后获得各系造血细胞分化的高水平重建。上图显示的为将5×104脐带血CD34+细胞移植16周后，在NPG小鼠外周血中检测到高水平的人CD45+细胞（46.54%）、CD19+ B细胞（70.9%）、CD3+ T细胞（17.33%）和CD33+髓系细胞（8%）。
图9 人造血干细胞（HSCs）移植NPG小鼠后各系细胞重建。脐带血CD34+细胞移植NPG小鼠12周以及更长时间之后，人源造血细胞稳定重建，T细胞所占比例逐渐升高。
④NPG小鼠肿瘤免疫治疗的相关研究
图10 人肿瘤细胞移植NPG小鼠后更容易成瘤。上图为使用NPG小鼠和BALB/c裸鼠，皮下接种人黑色素瘤细胞A375SM后，活体成像的肿瘤示踪图，可见NPG小鼠成瘤，与裸鼠相比，大小更均匀，生长到一定体积需要的时间相对更短。
4. 应用领域
（1）人源细胞或组织移植
（2）肿瘤和肿瘤干细胞研究
（3）ES和iPS细胞研究
（4）造血和免疫学研究
（5）人类疾病感染模型研究
（6）人源化动物模型研发
5. 参考文献
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