研究癌症的发生：用直接源自重编程肝细胞的类器官模拟肝癌的发生

通常，在癌症的研究中，我们用癌症与正常组织或细胞相比来倒推可能发生了什么，从而推测其机制。但这或许根本无法了解到真实情况的本质，也根本无法称之为对癌症的发生进行研究。所以，虽然这个研究是去年发表的，但我觉得还是非常有价值。希望大家将来的研究中就不要轻易的说研究某某基因在某某癌症的发生发展中的作用机制了...

直接源自重编程人肝细胞的类器官模拟肝癌的发生

Modelling liver cancer initiation with organoids derived from directly reprogrammed human hepatocytes

摘要

人肝癌，包括肝细胞癌和肝内胆管癌，通常确诊时已为晚期，且预后较差。更好地理解癌症的发生（cancer initiation，癌症启动的意思，从无到有，但是对应的中文名词未不到，所以最终觉得用发生还是最合适的）可以提供潜在的预防性治疗并增加生存率。研究人类肝癌起始的模型在很大程度上缺失。通过使用直接重编程的人肝脏细胞（hiHeps）并使p53和RB失活，我们建立了具有肝脏结构和功能的类器官。HiHep类器官被遗传工程化，以模拟人肝癌的初始变化。真正的（bona fide）肝细胞癌是通过过度表达c-Myc而产生的。c-Myc诱导的线粒体-内质网过度偶联促进了肝细胞癌的发生，这可能是预防性治疗的靶点。此外，通过对人肝内胆管癌的突变的富集分析证实，Notch和JAK–STAT的联合抑制作用可以防止RAS诱导的从肝细胞向肝内胆管癌细胞谱系的转化。综上，hiHep类器官代表了一个可以进行基因操纵以模拟癌症发病并识别潜在预防疗法的系统。

主要结果

图1 具有改良肝结构的hiHep类器官的制备。

a 制备hiHep类器官的示意图。此前该课题组通过过表达转录因子FOXA3, HNF1A和HNF4A让成纤维细胞转分化成诱导肝细胞（hiHep），并通过SV40LT使细胞扩增。b HiHep细胞自我组织形成类器官，并展现出光滑的球状结构。比例尺，100 μm。c 类器官中hiHep细胞显示出伴有椭圆形细胞核的多边形形态（箭），并交织形成胆小管样结构（箭头）。比例尺，50 μm。 d 透射电镜图像显示典型的胆小管结构（箭头）和紧密连接（箭头）。比例尺，1 μm。e，具有微绒毛的典型上皮细胞的透射电镜图像（箭头）。比例尺，1 μm。f，hiHep类器官中富集的线粒体（箭头，成熟肝细胞的标志）的透射电子显微镜图像。比例尺，0.5 μm。b–f 中的实验独立重复了3次，结果相似。

图2 HiHep类器官具有改善的肝功能。

a，hiHep类器官中肝细胞特异性蛋白HNF4A和E-cadherin的免疫荧光染色显示出高表达，而胎儿肝蛋白甲胎蛋白AFP检测不到（补充图1c）。图像结果的相似的三个独立实验的代表。比例尺，100μm。 b，进行主成分分析以比较人类成纤维细胞，2D培养的hiHep细胞，hiHep类器官和PHH（原代人肝细胞，n = 2（成纤维细胞，2D hiHeps和类器官）和3个（PHH）生物学独立的样品）的表达谱。虚线表示PC1的得分为“0”。结果显示hiHep类器官聚类情况跟培养的PHHs很相近。c，hiHep类器官和2D hiHeps的RNA测序数据的GSEA（基因集富集分析）。与二维培养的hiHeps，hiHep类器官具有更丰富的肝功能，包括糖原存储，药物代谢，转运蛋白和类固醇生物合成（每组n = 2个生物学独立的样本； FDR q <25％）。NES，标准化富集评分。d，长期培养的二维hiHeps和hiHep类器官中肝基因的RT–qPCR数据（n = 4个独立实验）。肝基因持续表达了两个月。e，二维hiHeps和hiHep类器官的增殖速率（n = 3个生物学独立的重复样本）。hiHep类器官中肝细胞增殖速度更低。f，hiHep类器官和2D hiHeps的白蛋白分泌水平通过ELISA测定（n = 4个生物学独立的样品）。g，糖原存储量通过比色法（n = 3个生物学独立的样品）进行定量。h，通过ELISA测量APOA1分泌水平（n ＝ 3个生物学独立的样品）。i，在5 μM睾丸激素中孵育4小时后，通过质谱法测量睾丸激素的代谢能力（n = 3个生物学独立的样品）。解冻后培养2 d的冷冻保存的PHH用作阳性对照。 HepG2细胞也用作对照。 n.d.，未检测到。数据表示为平均值±s.e.m.在d，f–h中。所有P值均使用双未配对Student t检验计算得出。补充表5中提供了统计数据的源数据。

图3 c-Myc类器官原位移植后真正的HCC的形成。

a，GFP（左，对照）和c-Myc（右）类器官中c-Myc蛋白的免疫荧光分析。比例尺，50 μm。b，RT-qPCR分析表明c-Myc相关基因的诱导持续了60 d（n = 4个独立实验）。数据表示为平均值±s.e.m. c，GFP（左）和c-Myc（右）类器官的形态。HCC由hi-Hep类器官中的c-Myc过表达（c-Myc类器官）引发。比例尺，100 μm。d，来自c-Myc类器官（左）和代表性的c-Myc阳性人HCC的HCC的代表性的体内组织H＆E染色（右；参见方法）。注意两种癌症都表现出紧凑性（GFP类器官HE染色怎么没放这里？从下面的图看，好像也是类似结构...）。箭头表示高有丝分裂活性（说实话，这个结果看起来很模糊）。比例尺，50 μm。e，c-Myc-类器官来源的HCC的c-Myc（左），Ki67（中）和GPC3（右）染色。比例尺，50 μm。在a，c–e中的实验独立重复了三次，结果相似。补充表5中提供了统计数据源数据。

图4 HiHep类器官在体外模拟c-Myc诱导的HCC发生。

a，培养过程中c-Myc类器官的代表性H＆E染色。第2代的GFP类器官作为对照。箭指示紊乱的结构。箭头指示的是细胞核与细胞质比例增加的细胞。P2 day 16显示了细胞核异型性的增多。该实验独立地重复了三遍，结果相似。比例尺，50 μm; P1，通道1；P2，通道2。b，c-Myc类器官富含MYC激活通路。c，c-Myc类器官富含c-Myc特征基因（signature gene，请参见方法）。d，c-Myc类器官中已知的肝癌病因的关键通路基因的GSEA，脂肪肝（左）和肝纤维化（右）（请参见方法和补充表4）。b–d，FDR q <25％；每组n = 2个生物学独立的样本。

图5 c-Myc类器官中线粒体-内质网（ER）过度偶联。

a，GFP（左）和c-Myc（右）类器官中线粒体和ER膜的代表性超微结构图像。c-Myc类器官中ER膜与线粒体紧靠。箭头指示ER膜的位置。图像代表三个独立实验的结果相似。比例尺，0.5 μm。b，定量分析位于线粒体附近的ER百分比（n = 3个独立实验；每组共分析40张图片）。c，GSEA表明，c-Myc类器官中富集得到了线粒体的组装和生物形成（左）和分裂（右）途径（FDR q <25％）。d，100 μM ATP刺激后线粒体中Ca2 浓度的变化痕迹。数据为平均值（每组记录> 50个细胞；n = 4个独立实验）。e，ATP刺激后Ca2 峰值的定量（n = 4个独立实验；每组定量> 50个细胞）。f，c-Myc和GFP类器官（n = 3个生物学独立的样本）耗氧率（线粒体呼吸）。g，c-Myc类器官中葡萄糖代谢过程的GSEA。FDR q <25％。h，用3 μM MitoSOX上样（n = 3个独立实验）测量ROS的产生。i，c-Myc类器官中对氧化应激的细胞响应的GSEA分析。FDR q <25％。j，通过RT-qPCR测定（n = 4个生物学独立的样品）发现，在用10 μM Mdivi-1（抑制DRP1，以阻断内质网和线粒体之间的作用和线粒体分裂）处理10 d的c-Myc类器官中，c-Myc相关基因的表达水平下调（参见方法）。每组c，g，i，n = 2个生物学独立的样本。数据表示为平均值±s.e.m. （b，e，h）和平均值±s.d。（缩略词）。所有P值均使用双尾非配对Student t检验计算得出。补充表2中显示了流式细胞术分析的设门方法。补充表5中提供了统计学源数据。

图6 在hiHep类器官中诱导ICC（肝内胆管细胞癌，另一个主要的肝癌为肝细胞癌HCC）过程中富集于ICC的基因突变。

a，第5天，用富含ICC的致癌突变转染后的hiHep类器官形态。比例尺，100 μm。b，第13天转染了富含ICC致癌突变的hiHep类器官的组织学变化。比例尺，50 μm。c，转染了富含ICC致癌突变的hiHep类器官的形态和结构变化的概况（n = 400个生物学独立的样品）。数据表示为平均值±标准差。 ，表示有相关特征（用粉红色阴影表示）；−，无相关特征。d，在癌基因转染的hiHep类器官中基因表达水平的聚类。具有RASG12V过表达的HiHep类器官显示出与人类ICC相当的表达模式（从右侧数第二个）。通过RT-qPCR在转染了ICC富集突变的类器官中测量了ICC相关基因的表达，包括胆管细胞标志物，Notch靶基因，粘蛋白相关基因和细胞因子以及肝细胞基因。RNA测序数据用于c-Myc类器官和TCGA提取的人ICC和HCC（请参见方法）。在a-c中进行的实验独立进行了3次，结果相似。补充表5中提供了统计数据源数据。

图7 RAS在体内和体外均可诱导出ICC特征。

a，通过hiHep类器官中的免疫荧光RAS染色确定RAS过表达。比例尺，50 μm。b，RAS-类器官来源的ICC（左）和RAS突变的人ICC样本（右）的代表性H＆E染色。比例尺，50 μm。c，在体内RAS-类器官来源的ICC中对Ki67，CK19，MUC5和分泌的粘蛋白（阿尔辛蓝）的染色。比例尺，50 μm。d，体内RAS-类器官来源的ICC的CK7，SOX9和MUC1染色。由Pwpi.1载体表达的GFP用于验证ICC是否源自RAS类器官。比例尺，50 μm。e，RAS和类器官衍生的ICC中RAS和CK19的共免疫染色。比例尺，50 μm。f，GESA显示RAS类器官富含RAS特征基因的表达（请参见方法；FDR q <25％；每组n = 2个生物学独立的样品）。g-h，具有ICC（g）和胆管细胞（h）形态特征的RAS类器官的代表性透射电镜图像， 包括细胞内腔微绒毛形成（g，箭头）和基底膜形成（h，箭）。比例尺，0.5 μm。 a–e中的实验独立重复了3次，结果相似。g、h的实验做了一次。

图8 RAS在ICC形成过程中诱导肝细胞的谱系转化。

a，培养过程中RAS类器官的H＆E染色。箭头指示在RAS类器官中形成的液泡。比例尺，50 μm。b，免疫荧光染色（左）和MUC5（ICC的标记物）表达的RT-qPCR分析（右；n = 4个生物学独立的样品）。数据表示为平均值±s.d. 比例尺，50 μm。c，RAS类器官中富集到了RAS特征基因。d，GFP和RAS类器官的分级聚类。根据指定天数的GFP和RAS类器官的肝和胆管细胞基因的表达进行分层聚类。肝和胆管细胞基因的选择基于Tarlow及其同事的研究37（见补充表3）。e，LPC（liver-progenitor cell，肝脏祖细胞）标记物在GFP器官、RAS类器官和iPSC来源的LPC细胞中的表达。来源于iPSC的LPC的数据是从Gene Expression Omnibus数据库（GSE61948）下载的。f，胆管细胞（左）和LPC富集基因的表达的归一化富集分数（右；参见方法）。g，Notch（左）和JAK-STAT（右）信号通路富集于RAS类器官。c,f,g，通过将第2、6和16天的RAS类器官与GFP类器官成对比较，对数据进行GSEA分析。具体的归一化富集得分显示在图表上。c,f，* FDR q <25％和P <0.01，g，FDR q <25％; UD，未检测到。h，用Crenigacestat（Creni，10 μM），Nifuroxazide（Nifu，10 μM）以及Crenigacestat和Nifuroxazide组合治疗10 d后RAS类器官的相对细胞数（n = 3个独立实验）。数据表示为平均值±s.e.m. P值是使用双尾非配对Student t检验计算的。i，用Crenigacestat和Nifuroxazide（n = 4个生物学独立的样品）处理后，对RAS类器官中ICC相关基因的定量PCR分析。虚线表示mRNA水平＝ 1。数据表示为平均值±s.d。a，b中的实验独立重复了3次，结果相似。c–g，每组n = 2个生物学独立的样本。补充表5中提供了统计数据的源数据。

展望

在肝癌的起始过程中，肝癌突变可能与基质细胞相互作用。因此，在未来的研究中可能需要引入其他类型的细胞，例如免疫系统和基质成分。另外，通过逐步引入多个突变来表征肿瘤发生的进化，从而模拟肝癌的进展，这是很重要的一点。

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https://sci-hub.tf/10.1038/s41556-019-0359-5