Cell | 构建200多种不同的可降解激酶图谱
靶向蛋白降解（Targeted protein degradation, TPD）是一种新兴的有望克服传统药理学抑制方法局限性的治疗手段，通过使用小分子降解剂将E3泛素连接酶募集到原本不会被认作底物的目标蛋白（proteins of interest, POI）上，以“劫持”细胞降解机制【1,2】。截至目前，使用TPD策略已成功降解了来自不同蛋白质家族和结构类别的60多个POI。尽管将TPD作为一种新的药理方法进行广泛的探索，但仍然很难预测哪些蛋白质易处理，哪些可能对这种方法具有抵抗性。类似地，由于对结合的非线性依赖性，降解靶标谱通常与抑制剂选择性谱有很大差异，因此建立TPD目标空间需要更大量的经验数据集【3】。
近日，来自韩国科学技术学院的Taebo Simu团队，以及来自美国丹娜-法伯癌症研究所的Nathanael S. Gray团队和Eric S. Fischer团队在Cell杂志上合作发表了一篇题为Mapping the Degradable Kinome Provides a Resource for Expedited Degrader Development 的文章，在这项研究中，作者通过大规模化学探索靶向蛋白质降解的关键变量，建立了包含200多种不同的可降解激酶图谱，将其作为公共资源提供于平台（https://proteomics.fischerlab.org），并为未来开发的激酶降解剂提供了新的通用设计原理。
首先，作者开发了一个激酶靶向降解剂的大型文库，筛选出212种降解的蛋白激酶相关靶标，较先前报道的57种激酶数量显著增加（见下图1）。在建立了易于处理的目标后，作者接下来着手评估化学和细胞变量对TPD功效和选择性的贡献，主要包括细胞靶标参与，三元复合物形成、靶蛋白丰度、泛素蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system, UPS）、细胞系变异、募集的E3连接酶影响以及化学变量（例如接头长度等）。
图1. 靶向蛋白降解剂的作用方式及本研究采用的实验方法流程图
人们普遍认为降解剂会使功效与靶标占有率脱钩，作者通过使用KiNativ分析比较所有定量蛋白激酶的相对丰度变化和占有率，结果显示细胞靶标参与度与降解能力之间没有相关性，提示靶标结合不是主要的驱动降解功效的因素。有研究提出，降解剂的一个重要因素在于靶标-连接酶蛋白-蛋白相互作用的互补性差异使其具有提高靶标选择性的潜力【4】。为使化合物诱导的降解成功，三元复合物（连接酶-降解物-POI）的形成对于泛素转移至POI是必不可少的。随后，为了比较三元复合物的形成与靶蛋白在整个kinome中参与和降解之间的差异，作者在存在四种选择的多激酶靶向降解剂的情况下，通过实验评估了与CRBN形成复合物的激酶的广度。有趣的是，作者观察到许多激酶即使未形成可检测的三元复合物也被降解，表明瞬时或低丰度复合物也可导致有效降解。
已有研究表明靶标表达水平或局部浓度可能会影响靶蛋白降解性，作者想知道TPD效率对靶标蛋白表达水平的依赖性。为此，作者定量评估了三种正交细胞系MOLT-4，KELLY和HEK293T中蛋白质的相对表达，并对这些细胞系中四种多激酶靶向降解剂进行分析，结果也同样排除了靶蛋白表达水平作为细胞系之间降解差异关键驱动因素的情况。基于先前报道的不同的E3连接酶对泛素化特定蛋白的倾向差异，那么改变募集的E3连接酶是否对可及靶蛋白范围存在影响呢？作者发现一种CRBN募集的降解剂降解了70种不同激酶，而加入VHL后，额外鉴定出了16种降解的激酶，即相当于靶向激酶增加了23％。进一步的研究表明许多激酶存在连接酶偏好性，而这种偏好性在整个可降解激酶组中均成立。
事实证明连接子长度的变化会显著改变降解剂的选择性，为了系统评估连接子差异的重要性，作者合成了六个多靶标激酶降解剂并对其进行分析。数据显示，激酶靶标的数量随连接子长度的增加而降低，这是令人惊讶的结果，因为先前多次报道提出长接头比短接头能更有效地形成三元复合物并诱导降解。此外，在这一数据集中，一个激酶子集表现出较强的接头偏好性，包括对特定分子的偏好，对端接头的偏好或者对特定接头连接区域的偏好。因此，在缺乏经验数据或尚待开发的预测模型的情况下，可能需要通过广泛地摸索以合成恰当的连接子。
在先前的研究中已经证明AAA ATPase p97解折叠酶活性对于从多蛋白复合物，染色质或膜结合复合物中提取标记为降解的蛋白质而言是必不可少的【5】，然而，尚不清楚是哪些因素决定泛素化蛋白质的降解是以p97依赖性还是p97依赖性方式发生。在这项研究的最后，作者为了评估整个激酶组的p97依赖性，测量了单独使用四个靶向多激酶降解剂以及将其与p97抑制剂CB-5083的共处理后的蛋白质丰度变化。对处理组的分析显示，响应于降解剂而被下调的几乎所有激酶在抑制p97时均表现出一定的降解恢复作用，提示大多数可降解的激酶组均以p97依赖性加工；此外，作者比较了募集不同E3连接酶（CRBN，VHL和IAP）的多靶标激酶降解剂的结果，证实了这种p97依赖性独立于负责泛素化的连接酶。
靶向蛋白质降解是一个快速增长的领域，但降解剂的发展仍然是经验性的。总的来说，这项研究对激酶组的可降解性进行了广泛的分析，以解决当前缺乏从中提取TPD介导的降解的一般特征的数据集的问题。作者将精选的降解剂文库与基于质谱的定量蛋白质组学相结合，以绘制7种不同细胞系中200多种激酶的可降解性图谱，这个庞大数据集的建立加速了降解剂化学探针和整个激酶组中临床上相关的先导化合物的开发。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.038
制版人：十一
参考文献
1. Bondeson, D.P., and Crews, C.M. (2017). Targeted protein degradation by small molecules. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 57, 107–123.
2. Sakamoto, K.M., Kim, K.B., Kumagai, A., Mercurio, F., Crews, C.M., and Deshaies, R.J. (2001). Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8554–8559.
3. Olson, C.M., Jiang, B., Erb, M.A., Liang, Y., Doctor, Z.M., Zhang, Z., Zhang, T., Kwiatkowski, N., Boukhali, M., Green, J.L., et al. (2018). Pharmacological perturbation of CDK9 using selective CDK9 inhibition or degradation. Nat. Chem. Biol. 14, 163–170.
4. Farnaby, W., Koegl, M., Roy, M.J., Whitworth, C., Diers, E., Trainor, N., Zollman, D., Steurer, S., Karolyi-Oezguer, J., Riedmueller, C., et al. (2019). BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nat. Chem. Biol. 15, 672–680.
5. Ramadan, K., Bruderer, R., Spiga, F.M., Popp, O., Baur, T., Gotta, M., and Meyer, H.H. (2007). Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature 450, 1258–1262.