技术达人精品课20171220-王华【Q&A】（含获奖名单）

感谢大家积极参与直播交流互动提出好问题，直播课程结束时，小衡收到了40多条提问~~在这里，需要跟小伙伴说明一下，因为王华老师的《冰冻制片技术实践与理论》课程将会分四次，这次直播大部分问题都会在后续的课程中提及。所以这次挑选出与第一次直播内容相关的8个问题进行解答。其余未回答的问题，将会在后续的直播课中有所提及，请各位好学上进的伙伴们关注后续直播，寻找您自己的问题答案吧。

雁过无痕

理论上缓慢冰冻组织时，细胞外液逐渐形成冰晶，那么这样组织形态应该是均匀分布的细胞图像，每个细胞之间都应该有冰晶。而实际是细胞是团块样聚集在一起，那团块细胞间的细胞外液形成的冰晶呢？

王华

在切片中细胞之间的不规则透明间隙就是细胞外冰晶所在的区域，冰晶就是水分子的聚集，切片贴片后，冰晶就溶了，我们在切片里看到的空白不规则间隙就是冰晶所占据的位置。

李慧

王老师，我们的样本托是没有提前放在冰冻机中的，冰晶是否会容易形成？

王华

一切影响组织快速冷冻的因素，都会增加组织内冰晶的形成。组织托放在冰冻切片机箱体内（不在速冻台区域）预冷，可以有效缩短组织冷冻凝固的时间，减少冰晶形成的数量与体积，也有利于缩短整个冰冻制片流程的时间。

五月澜翼

多块组织即使全部都用冷冻锤冷冻完了，那后面切的组织与第一块组织的冰晶应该有差别的吧？毕竟有时间差的。

王华

组织冷冻凝固之后，水分子基本停止移动，冷冻凝固后在一段时间内切片，组织的形态结构影响不大。

闻祥红

做冰冻要用冷冻锤，跟冷冻台温度设置一20度，一40度没多大关系，应速冻，冰晶才会少，我说的对吗？

王华

冷冻锤的温度会对组织内冰晶的形成有很大影响的，这个在直播课上已经提到了。当然，在实际操作过程中，如果你掌握了冰晶形成的规律，用—20℃的冻锤也能做出好片子，就是粗修尽可能少，尽量取贴近冷冻锤的组织切片。

浙江省网友

王老师，我们做的是大鼠脑切片，并没有包埋液，有的时候片会有一些空洞，请问是形成了冰晶还是因为灌流不好？请问有什么解决方式？

王华

因为我从您的描述中不能理解所谓的“空洞”是什么样的，不能确定是不是冰晶，所以不能给您解决方案。但因为脑组织含水量高，如果冷冻不好，冰冻切片是容易出现冰晶的。

如沐春风

王老师，样本托滴的胶水有时很稀，把组织放在样本托上胶都外溢了，这时该怎样冷冻最好呢？如果在这时用冷冻锤，组织会被全部压塌掉，那么遇见这种情况，该怎样操作最妥当呢？

王华

很多普通胶水的粘稠度不够，太稀的胶水不好制片的，建议换粘稠度好的包埋剂，要不就买商品化的OCT。用粘稠度高的包埋剂，在组织冷冻的速度也更快，能缓解组织被压扁的情况的。试剂与耗材对制片流程的顺畅性和制片质量影响也很大的。

稳

王老师，我在做冰冻时，事先把组织托放入冰冻切片机速冻台上，发现当做冰冻时，加凝胶放组织速冻下来组织托跟组织黏得不牢固，修片时往往组织块掉落，导致重新速冻。那么请问该不该事先把组织托放到速冻台速冻呢？

王华

组织托太冷时，包埋剂滴加到组织托上，包埋剂还未完全渗入组织托的凹槽中就凝固了。包埋剂“悬空凝固”的状态就会导致组织托对包埋剂的“抓力”不足，在修片过程中容易脱离。所以，建议将组织托放在箱体中预冷即可，不要放在速冻台上预冷，准备加包埋剂的时候再把组织托放到速冻台上。

祥子

包埋剂的种类不一样会不会产生的冰晶的状态也不一样？

王华

不同的包埋剂在冷冻速度上可能会有差异，也会对组织冷冻速度造成影响。其实一切影响组织冷冻凝固速度的因素都会影响冰晶形成的状态。包括包埋剂的多少，组织的大小，速冻台冷冻锤的温度等因素都会影响冰晶形成的量和形态。我们在冷冻组织的时候就是用能实现的手段，缩短组织冷冻凝固的时间。

敲黑板~~这期精品课“提出好问题”的活动中，获奖的小伙伴是哪几位呢？

雁过无痕

五月澜翼

如沐春风

稳