ips细胞诱导因子的研究进展

人类胚胎干细胞（ES）具有分化为人体所有细胞类型的潜力，并在再生医学中具有较大的应用潜能。然而，免疫排斥却阻碍了使用人ES细胞的移植疗法。为避免免疫排斥的并发症，采用了多种方法来产生患者特异性的多能干细胞，例如体细胞核移植（也称为治疗性克隆）以及体细胞与人ES细胞的融合。但这些方法大多数都收效甚微。由特定转录因子处理后的体细胞产生的人诱导多能干细胞（hIPS）使产生用于治疗的患者特异性ES样干细胞成为可能。人类胚胎干细胞（ES）具有分化为人体所有细胞类型的潜力，并在再生医学中具有较大的应用潜能。然而，免疫排斥却阻碍了使用人ES细胞的移植疗法。为避免免疫排斥的并发症，采用了多种方法来产生患者特异性的多能干细胞，例如体细胞核移植（也称为治疗性克隆）以及体细胞与人ES细胞的融合。但这些方法大多数都收效甚微。由特定转录因子处理后的体细胞产生的人诱导多能干细胞（hIPS）使产生用于治疗的患者特异性ES样干细胞成为可能。

2006年，高桥和山中首次成功生产诱导多能性（iPS）细胞。他们在24个因子中选中4个处理胚胎和成年小鼠成纤维细胞并使这些细胞获得类似胚胎干细胞（ES）的特性。这4个因子分别是：OCT3 / 4，SOX2，c-Myc的和Klf4，被称为山中因子[1]。次年，高桥及其团队发现两组不同的四因子将体细胞重编程为多能细胞的效率相似，即OCT3 / 4，SOX2，c-Myc，Klf4和OCT4，SOX2，NANOG和LIN28[2-3]。iPS细胞形态，增殖，表面抗原，基因表达，端粒酶活性以及多能细胞特异性基因的表观遗传状态等特征与ES细胞中的相似[4]。而且同样的，IPS细胞也能够在体外和畸胎瘤中分化为三种生殖层细胞类型：外胚层，内胚层和中胚层。因此，由于IPS细胞具有产生用于细胞疗法的患者特异性细胞类型并产生没有胚胎组织或卵母细胞的体外疾病模型的潜能，在医学上具有广阔的前景。迄今为止，已有至少六种制备IPS细胞的策略：逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，质粒转染，转座子和重组蛋白。其中，大多数IPS细胞是由病毒转导产生的[4]。

2007年，Yu及其团队成为第一个使用慢病毒生成人iPS细胞的团队（过表达14个候选基因中的4个：OCT4，SOX2，NANOG和LIN28），其效率为0.01%[3]，与Takahashi等人使用OCT4，SOX2，c-MYC和KLF4的效率相同[2]。然而，这样低下的效率使得难以从少量初始细胞群体中生成足以支持其在临床试验中使用的患者特异性IPS细胞。次年，Liao等人同过六种转录因子的组合，提高了从体细胞生成IPS的细胞效率[5]。

Liao等人[5]将编码转录因子OCT4，NANOG，SOX2，LIN28，C-MYC和KLF4的人类基因克隆到慢病毒载体中，产生慢病毒。用携带4种因子或6种因子的慢病毒混合物转导人新生儿包皮成纤维细胞，以对比两种组合的重编程效率。转导24 h后，将细胞转移至饲养层细胞，并在ES培养基种培养。具有四因子实验组的细胞在转导后第12天IPS细胞集落变得可见，而六因子实验组的细胞在转导后第7天则变得可见。随后，该团队在转导后第17天分析碱性磷酸酶的表达以量化重编程效率。结果显示，四因子转导的105初始成纤维细胞种共16±3个阳性菌落，而六因子转导的1*105初始成纤维细胞种共166±6个阳性菌落，是四因子的10.4倍。随后，Liao等人[5]于第26天挑出四因子组产生的IPS克隆，并证明这些细胞表达碱性磷酸酶和SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和Tra-1-81等这些ES细胞特异性的细胞表面抗原。而由于六因子组的细胞生长速度的影响，六因子组的IPS克隆（以下简称IPS-S）必须于转导后的第17天挑出，否则细胞汇合度过高。被挑出的IPS-S的生长形态与作者实验室所培养的ES细胞系H1或HuES-17没有显著区别（Figure 1B）。

以上可见，四因子或六因子慢病毒混合物转导均能产生IPS细胞，但六因子的重编程效率高于四因子达10倍。据Liao等人[5]推测，这一结果可能因为添加c-MYC和/或KLF4可以防止细胞凋亡或调节细胞周期。去年，福田等人[6]对比了四因子及六因子诱导猪IPS的效率，结果显示六因子表达的猪IPS比四因子表达的猪IPS更具有优势。这一结果也可以侧面说明六因子转导较四因子转导更优越。除了重编程效率低下这一重要障碍，将外源基因整合到体细胞基因组中，尤其是MYC及KLF4这种癌基因，也是限制IPS细胞发展的一大局限[7]。在。

2008年，冲田等人[8]报告说，他们已经成功地产生了没有病毒载体的小鼠iPS细胞。他们将两个表达质粒（一个包含Oct3 / 4，Sox2和Klf4的cDNA，另一个包含c-Myc cDNA）共转染到小鼠胚胎成纤维细胞中，导致iPS细胞没有质粒整合的迹象。当移植到小鼠体内时，这些细胞会产生畸胎瘤并促成成年嵌合体。无病毒iPS细胞的这种生产解决了将其用于再生医学的关键安全问题。但是，此方法效率非常低（0.0015％）。2009年，Yu等人[9]使用相同的非病毒载体转染策略来生成人iPS细胞，他们应用的是三个包含六个转录因子（OCT4，SOX2，C-MYC，KLF4，NANOG和LIN28）的质粒。该方法实现了~0.1％的更高效率。他们还确定，生成的人iPS细胞完全不含载体和转基因序列，并且，就人的增殖和发育潜力而言，它们与人ES细胞相似。他们的结果表明，人类体细胞重编程不需要基因组整合或持续存在外源重编程因子，因此消除了人类iPS细胞临床应用的一个障碍。最后他们认为，如果该策略在实现更高效率的同时仍不触发c-MYC和KLF4癌基因，则可能成为产生iPS细胞的最佳方法。

诱导多能干细胞是细胞治疗和再生医学的宝贵资源。尽管使用多种方法生成iPS细胞变得很常规，但许多现有技术尚未在人体细胞中进行严格研究。然而，关于iPS细胞的基因组和表观基因组的不稳定性，体细胞记忆或免疫原性的日益增长的关注需要进一步的研究。优化重编程方案和有效的细胞分选可能可以克服现有的障碍，以将临床级iPSC用于即将到来的干细胞疗法和再生医学。

参考文献
[1] Takahashi, K., & Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. cell, 126(4), 663-676.
[2] Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., & Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. cell, 131(5), 861-872.
[3] Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S.& Thomson, J. A. (2007). Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. science, 318(5858), 1917-1920.
[4] Liu, S. P., Fu, R. H., Huang, Y. C., Chen, S. Y., Chien, Y. J., Hsu, C. Y& Lin, S. Z. (2011). Induced pluripotent stem (iPS) cell research overview. Cell transplantation, 20(1), 15-19.
[5] Liao, J., Wu, Z., Wang, Y., Cheng, L., Cui, C., Gao, Y& Xiao, L. (2008). Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell research, 18(5), 600-603.
[6] Fukuda, T., Doi, K., Donai, K., Takahashi, K., Kobayashi, H., Hirano, T., ... & Yasue, H. (2019). Global transcriptome analysis of pig induced pluripotent stem cells derived from six and four reprogramming factors. Scientific data, 6, 190034.
[7] Rony, I. K., Baten, A., Bloomfield, J. A., Islam, M. E., Billah, M. M., & Islam, K. D. (2015). Inducing pluripotency in vitro: recent advances and highlights in induced pluripotent stem cells generation and pluripotency reprogramming. Cell proliferation, 48(2), 140-156.
[8] Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., & Yamanaka, S. (2008). Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 322(5903), 949-953.
[9] Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., & Thomson, J. A. (2009). Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science, 324(5928), 797-801.