这工作量才发5 ？

文章发表杂志概况：

<American Journal of Cancer Research> ISSN: 2156-6976;

2018_IF = 4.737; 2019_IF = 5.177;

中科大类: 医学 2区;

中科小类: 肿瘤学 3区;

JCR分区: Q2

推文简述：

The University of Texas at Austin于今年8月发表在American Journal of Cancer Research上的整合肿瘤免疫网络分析，研究针对于癌症患者的体细胞免疫反应突变，开发出潜在的免疫应答(NIPPER)的网络模型，发现该模型鉴定出的基因多与免疫治疗相关，并可以作为药物相关基因，进行免疫调节候选药物筛查。

小编看了一下Dr.Song实验室和个人研究经历，着实优秀的，有兴趣可以浏览：https://www.bme.utexas.edu/people/faculty-directory/yi

免疫基因数据收集：

从ImmPort项目中获得人体免疫相关基因(http://www.immport.org), 17个免疫相关通路共1811个基因。另外文献挖掘到essential immunotherapy genes，定义为第18类免疫通路。所以最终涉及2273个免疫相关基因。

癌症队列和表达数据收集：

通过R-package “TCGAbiolinks”从TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）获取33个癌症项目类型包括生存状态、阶段、等级、生存时间和RNA-seq数据。Synapse获取体细胞突变数据涉及10,224名患者，得到每个突变的保守和MetaSVM评分。免疫治疗组的两组基因表达数据，GSE35640 -- 接受MAGE-A3免疫治疗的转移性黑色素瘤患者和GSE78220 -- 接受抗pd -1治疗的黑色素瘤活检样本。

细胞系突变的功能测定和肿瘤纯度评估：

此外，本研究还使用了来自ATCC细胞系，两次传代后用于实验。BaF3和MCF10A两株细胞系，通过与对应的野生型比对，测定细胞系突变的功能测评。根据TCGA中33类癌症的基因表达数据估计混合细胞群体中成员细胞类型的丰富度，包括评估免疫评分、基质评分和肿瘤纯度。

相关指标评估：

途径突变负荷（PMB）评分是评估免疫途径在特定癌症类型中是否可能发生突变。该评分考虑了突变基因的比例以及每种癌症类型的患者覆盖率。对于j型癌症中的免疫通路i，评分定义如下:

mij是免疫基因通路i突变的数量;mi是基因通路i的总数;nij是癌症j基因突变途径i中病人的数量;nj是测序在癌症患者j的总数。

研究者从基因表达估计的三个免疫应答相关评分。根据ESTIMATE评估代表肿瘤组织中免疫细胞浸润的免疫评分。“核心”MHC- i集合(包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP1, TAP2, NLRC5, PSMB9, PSMB8和B2M)的平均表达水平确定MHC评分。基于两种关键的细胞溶解效应因子颗粒酶A (GZMA)和穿孔素(PRF1)的转录水平确定CYT评分。

使用domainXplorer算法来识别与免疫评分相关的蛋白质区域。domainXplorer使用三种统计检验来评估功能蛋白区域的突变是否与免疫应答相关评分相关。第一个线性模型定义如下:

其中“ImS”为每位患者的免疫评分，“T”为每位患者的起源组织(此处为癌症类型)，“D”表示功能区域是否发生突变。使用Wilcox秩和检验来比较被分析的功能区域突变患者的免疫反应相关评分与那些在相同免疫基因的其他区域突变的患者的评分(test -2)或免疫基因完全没有突变的人(test-3)。评判标准是p1<0.05, p2<0.05, p3<0.05与免疫应答相关。

为了评估基于免疫基因差异表达的癌症类型的相似性，计算了每对癌症的Jaccard指数：

在DEGi和DEGj是癌症免疫基因的差异表达类型i和j。

基因集富集分析：

根据差异表达分析衍生的FDR的负log10乘以logFC (log fold change)的符号对基因进行排序。“加权”富集统计数据用于计算特定癌症类型中每个免疫通路的富集或缺失。

新抗原的预测和突变的功能筛选：

使用NetMHCpan 4.0基于突变和信息进行新抗原预测HLA等位基因。提取8-11个氨基酸的野生型和突变型肽段，并预测其结合亲和力。将预测的亲和度排序与一组随机的天然肽进行比较。强结合肽的Rank阈值为0.5%，弱结合肽的Rank阈值为2.0%。0.5%的cutoff值用于定义引起新抗原的突变。

基于网络的挖掘免疫相关基因和药物：

对免疫失调基因进行优先排序，从一个完整的功能网络中提取免疫相关基因形成的子网络，该子网络的主要组成部分包括1,202个免疫相关基因之间的6060个相互作用。然后根据基因表达与免疫评分、MHC评分、CYT评分的相关性对免疫基因进行排序。选择与免疫、MHC、CYT评分正相关或负相关较高的50个基因作为种子基因。与免疫相关评分相关的突变基因也被整合为种子基因。random walk with restart算法模拟遗传变异的延续。当一个免疫基因在网络中排名在前50位时，初始值为“1”。然后将遗传改变沿邻域进行传播，计算网络中所有基因的遗传改变概率，公式如下:

P0是最初的二元概率向量,一个代表一个degree-normalized免疫子网的邻接矩阵,和α决定通过网络扩散程度的遗传影响。分析确定α= 0.7为最优值，多次迭代得到概率值，得分高于平均概率的基因被确定为每种癌症类型的免疫失调基因。

接下来，整合药物相关基因标记，识别每种癌症的候选药物。我们首先从The Connectivity Map中获得了表达特征基因 (也称为CMAP)，每种药物都有两种特征基因，一种是上调基因，另一种是下调基因。使用超几何检验来评估药物干扰基因标记是否在癌症特异性免疫基因集中富集。得到每种癌症类型的p值，然后将33种癌症类型的所有p值合并为一个组合p值。

其中w为各p值的权值，z为各p值的z分数。这里，所有的p值设置相同的权重。选择adjusted-pval小于0.01的药物。我们获得了具有上调/下调基因标记的药物，这些标记富集了与免疫评分正/负相关的基因。

 

生存分析：

根据特异性免疫基因的中位表达情况将患者分为两组。采用Log-rank检验评价两组患者的生存差异。p值小于0.05的基因被认为具有显著性。

捋清楚研究人员的课题设计，看一下最终肿瘤免疫到底呈现了一个什么样的网络以及是测评出的药物基因有哪些。

1. 肿瘤的免疫反应预测

如图1A所示，预测患者的免疫反应是可以用过基因标记实现的，这里首先评估三种不同的免疫基因表达特征是否与免疫治疗反应相关:1)免疫评分 2) MHC评分3)溶细胞活性。根据对MAGE - A3免疫治疗反应的基因表达数据，发现对免疫治疗有反应的患者具有明显较高的免疫评分(p=0.003)、MHC评分(p=1.7e-4)和细胞溶解活性(p=0.007，图1B)。此外，我们发现这三种免疫相关评分确实将有应答者与无应答者区分开来0.71-0.79(图1C)。接着看一下评分在癌症中的测评情况，计算TCGA中所有癌症的患者的三项评分，如图1D，免疫相关评分的分布是不同的。例如，肾透明细胞癌(KIRC)患者的肿瘤表现出较高的免疫相关评分，此外，虽然三个免疫相关评分似乎相互相关，但皮尔逊相关系数PCC范围为0.51-0.79(图1E)。结果表明，这些评分可能是互补的，因此整合这些评分将有助于鉴定新的候选基因靶点的免疫治疗。

(图1，癌症的免疫反应预测特征)

2. 免疫突变负荷分析确定关键途径和基因

有研究表明，免疫通路的突变可能影响肿瘤免疫相互作用。这里展示的前文提到的18个免疫通路的2273个免疫基因与患者的预后关系。根据定义的通路突变负担(PMB)评分，以评估肿瘤中基因组改变对每个免疫相关通路的干扰程度。发现由CRISPR-Cas9 KO筛查鉴定的必需基因在所有癌症类型中PMB得分较高(图2B)，此外在LUSC、SKCM和DLBC的另一条途径-细胞因子受体（CRs）有较高的PMB评分。如图2C所示，重点研究了LUSC中的CR突变，CR通路的突变表现为互斥模式。

(图2，癌症中关键变异的通路和基因)

3. 人类免疫系统在癌症中RNA水平的改变情况

这里研究了在基因表达水平上人类免疫体多大程度上在癌症中发生了改变。首先对每个样本的肿瘤纯度进行估计，并在回归模型中以肿瘤纯度为协变量对差异表达基因进行鉴定。发现与其他编码基因相比，免疫相关基因在癌症中显著受到干扰（图3A）此外发现，根据不同表达的免疫相关基因的相似性计算出每对癌症的Jaccard指数，组织起源相似的癌系聚集在一起（图3B），如肺腺癌(LUAD)和肺鳞状细胞癌(LUSC)，胆管癌(CHOL)和肝肝细胞癌(LIHC)，以及三种肾癌。这些结果表明，这些类型的肿瘤在相似的肿瘤微环境中表现出免疫组特征。

根据基因表达差异对所有基因进行排序，并使用基因集富集分析，16/18免疫相关通路在至少一种癌症中发生显著改变(图3C)。现在乳腺浸润性癌和胶质母细胞瘤中，抗原处理和呈递途径可能被激活(BRCA和GBM，图3C-D)。此外，细胞因子和细胞因子受体通路被抑制（BRCA和GBM，图3E-F）。

（图3，人类免疫系统在癌症中RNA水平的改变情况）

 

4. 与免疫反应相关的关键基因区域

考虑到免疫相关评分对预测免疫反应的重要性，接下来确定免疫候选驱动区域的癌症突变是否与这些评分显著相关，图4A所示，145个免疫相关基因中有209个蛋白区域可能与癌症免疫相关，七个基因(UBXN1, LTBP2, STAT1，NGFR、NRAS、MET和LTBP4)与三种免疫相关评分均显著相关。发现病人EGF_CA结构域突变显著提高了免疫评分、MHC评分和细胞溶解活性(图4B, p<0.05)。与免疫评分、MHC评分和细胞溶解活性相关的蛋白区域与TIIC丰度相关的蛋白区域明显重叠(图4C)。特别是与CD8 T细胞、中性粒细胞和树突状细胞相关的蛋白区域数量更多。而图4D展示的是， 7个基因的突变与所有三种免疫相关评分相关，它们与至少一种免疫细胞丰度相关。例如，LTBP4突变的患者CD8 T细胞和中性粒细胞的丰度明显更高(图4E)。这些结果表明，基因组的改变可能通过影响肿瘤的免疫细胞浸润而促进免疫治疗反应。

（图4，癌症中免疫反应的关键蛋白区域）

 

5. 癌症中新抗原的关键基因富集

蛋白质编码基因突变导致的新抗原比例有限，大约1.2%的免疫相关基因突变可能产生新抗原(图5A)。与一般编码基因相比，免疫相关基因 (来自ImmPort) 倾向于产生更多的新抗原(如PIK3CA、MUC4、EGFR)(图5A, p=1.18e-4, Fishertest)。PIK3CA和HRAS中大约25%的突变可以产生新抗原(图5B)。这一结果与其他文献中RAS在免疫治疗中发挥作用的观察结果一致。基于两种细胞系(Ba/F3和MCF10A)的活性功能筛选，发现编码新抗原的突变可能会激活两种细胞系的突变(图5C-5D)。在PIK3CA中鉴定了46个可能产生新抗原的错义突变。在这些突变中，功能数据集中有41个突变。其中40个突变是激活突变，一个是灭活突变。此外，我们在PIK3CA中发现了一个突变簇(包括R38C/H、E81K、R88Q、R93W、K111E和R115L)(图5 E)。对于EGFR，鉴定出17个突变可以产生新抗原。在两个细胞系中，共有14个突变进行功能筛选，其中11个突变为激活突变，2个为中性突变，1个为非决定性突变(图5D)。另外还发现7个突变形成了一个3D簇(包括R108K、R252/P/C/H和A189V/D，图5E)。假设，导致蛋白构象变化的功能性突变可能更容易被MHC分子识别以进行免疫剪枝，但如果这些突变随后抑制炎症信号，则可能会导致肿瘤细胞的增殖并激活突变。

（图5，免疫相关基因中富集的新抗原）

6. 基于免疫体网络的候选免疫应答优先排序

上述结果表明，在癌症免疫组网络中广泛存在基因组和转录组扰动。因此，研究人员提出了一个基于网络的综合模型来优先考虑潜在的免疫应答基因(NIPPER)(图6A)。简单地说，首先确定了突变或表达与免疫评分、MHC评分和CYT评分显著相关的基因。这些基因被映射到一个免疫相关蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络中，该网络由1,202个免疫相关基因之间的6060个相互作用组成。接下来，突变效应在PPI网络中传播。最后，将驱动概率大于预期的基因确定为免疫应答相关的签名基因。所有类型的癌症都重复了这个过程。所有类型的癌症都重复了这个过程。这里分别对与免疫相关评分正/负相关的基因进行分析。如6B,根据上述模型，确定了33种癌症类型中的39个基因作为特征基因，这些基因的高表达可能与免疫相关评分相关。这些基因参与了11个免疫-相关通路，8个基因(如STAT1、B2M、TAP1、TAP2)已被确定为免疫应答的必要基因。此外，我们发现这些候选的免疫应答相关基因在PPI网络中作为模块聚集在一起 (图6C)。研究人员还确定了一个候选基因——pdia3，它连接了7个已知的必需基因。并且在CESC、LUAD、HNSC和GBM等几种癌症类型中，该基因的表达与患者生存相关(图6D)。接下来，对接受过T细胞转移治疗的黑色素瘤队列中验证了这些基因，发现这些基因的表达可以区分有反应者和无反应者，曲线下面积为0.713(图6E)。这些基因的平均表达与总生存率的提高显著相关(图6F, log-rank p=0.02)。综上这些结果表明，NIPPER所识别的信号网络与多种免疫治疗模式的反应有关，并可能对关键的信号级联，从而有针对性地改善免疫治疗的结果。

（图6，基于网络的免疫应答器候选识别）

7. 潜在药物评估

最后评估了NIPPER在不同癌症中发现的基因突变。在这里，对所有优先基因突变的癌症类型进行了分析。我们发现这些基因的突变可能改变HLAs的结合力(图7A, p<0.001，Wilcox’s rank sum test)。具体地说，在28个基因中发现了135个突变，它们干扰了HLAs的结合，6个突变是降低HLAs结合力(图7B)，还有一些突变聚集在a中可能的功能点（图7C），而N564D和K567E突变可以促进癌细胞的生长(图7D)。这些结果表明，我们的基于网络的方法通过其与HLAs结合亲和力的变化，有助于识别癌症功能突变。另外，基于GESA分析，获得了6000多个小分子及其微扰基因签名图，49个显著干扰免疫基因签名表达的小分子(p<0.05，图7E)，所以综上，这个基于网络的模型，确实有筛选药物的功能。

（图7，候选HLA扰动突变和免疫应答小分子）