基因敲除斑马鱼构建方法!

一、基因敲除的设计方案

1.1 基因的基本信息
确认斑马鱼基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI等查询。
 
1.2 分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析
 
1.3分析蛋白质的保守结构功能域
通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。
 
1.4 分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况
一般使用CCTOP，少数物种如没有可找其它专业网站。
 
二、CRISPR活性验证

2.1 分析并确认基因组序列
设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到1.4重做。
该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作。
 
2.2 合成sgRNA
使用Thermo转录试剂盒转录，完成后需测定浓度（不得低于400 ng/μl） 和OD值（260/280需在1.8~2.2）。
 
2.3 显微注射
将上述合成好的sgRNA按照一定的比例与Cas9蛋白预混，使用显微注射技术将其注入斑马鱼早起胚胎中。
 
2.4 活性验证
随机选取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通过PCR后将其产物送商业公司sanger测序，需要看到至少有一组在靶向位置存在Indel突变。

• 如有，挑取存在Indel突变的亚克隆确认；

• 如没有，回到2.3或2.2或1.4（具体回到哪一步需要根据实际情况决定）

三、突变体制备及确认

3.1 F0饲养
如2.4验证有活性，一般需要显微注射400~500枚胚胎作为F0（一般由胚胎发育至成体有10~20%），至少需要40尾以上的F0。
 
3.2 F0可遗传突变的确认
将上述F0亲本与野生型杂交（或者自交），将所产胚胎随机选取8枚经测序确认，如存在Indel突变，则该F0亲本即为可遗传突变体。以此方法至少鉴定出3尾可遗传的F0。
 
3.3 F1饲养
将3.2至少3尾亲本经交配，每组一般15~25尾，一般总量需到达40~50尾。
 
3.4 F1确认
将3.3的F1饲养至2~2.5月龄,获得其尾鳍基因组，通过PCR后测序确认其具体基因型（要求必须是移码突变或出现提前终止密码子的突变）。
 
四、最终交付产品

至少获得3尾以上移码突变F1代斑马鱼（不限雌雄、不限具体突变类型），以及上述结项报告一份。
 
后续服务
一般客户拿到3尾移码突变斑马鱼并不能直接做实验，还需要继续扩繁、建系或做后研究等，因此我们也有后续服务。
 
五、突变体传代

释义：根据客户具体要求，通过自交（或者杂交），将某一种（或者多种）突变型扩大种群（或保持种群。
根据客户常规要求，我们一般提供30~40尾（雌雄各不少于8尾）经尧顺禹鉴定后的确认为突变体的Fn+1代斑马鱼。
 
六、表型观察及基因功能研究