基因敲除稳转株:点突变
通过核转染法将gRNA载体(含Cas9)和Donor共转入细胞中,gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后,细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复(HDR),将目标点突变重组到基因组靶位点。
gRNA载体携带抗性,可进行药筛,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序,筛选出点突变纯合的阳性克隆。
点突变方案:
服务流程及质量控制
应用案例
PSEN1基因A79V突变可引起阿尔茨海默症。研究表明,将阿尔茨海默症患者的体细胞诱导为多能干细胞(iPSC),然后通过用野生型序列替换点突变序列,修正突变的基因。通过研究患者的iPSC和修正后的iPSC,可以得知该突变对细胞表型的影响,从而深入研究该突变的病理性作用。
iPSC中PSEN1基因的序列分析
A_点突变修正后的杂合子测序结果。
B_ 点突变修正后的纯合子测序结果(T>C)
Reference:
Fukuda, N., Senga, Y., & Honda, S.(2019). Anxa2‐and Ctsd‐knockout CHO cell lines to diminish the risk of
contamination with host cell proteins. Biotechnology progress, e2820.
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