克服肿瘤靶向治疗耐药的新策略

近二十年来，肿瘤领域的药物研发主要以分子靶向药为主。然而，随着临床上靶向药的广泛使用，靶标突变造成耐药性的迅速出现严重降低了药物疗效，如何克服耐药性已成为当前抗肿瘤药物面临的主要问题。各大药厂和科研机构纷纷致力于阐明导致耐药的特定突变或其他遗传学/细胞学上的变化机制，为开发更有效的治疗策略提供基础支持，近年来涌现了包括非经典结合模式药物、蛋白水解靶向嵌合体（PROteolysis Targeting Chimeras，PROTACs）药物，靶向变构位点药物（Allosteric Drugs），多位点药物等策略来限制耐药性的出现。除此之外，在药物开发的早期，如能结合耐药性分析还可以帮助设计和评估对患者有长期益处的治疗方法。

从机制上来看，化学小分子抑制剂具有选择性地阻断其靶标的功能，不仅可以作为探针根据细胞动态变化来评估潜在的治疗策略，并可以作为药物开发的起点，多个抗肿瘤上市药物均从此而来。例如，BCR-ABL融合信号异常或肺癌中表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）激酶突变体活性上调与白血病发生发展密切相关，阻断其活性可以有效改善临床结果，这些研究带来BAR-ABL/EGFR靶向药物研发的热潮。这些靶向药物上市后对白血病治疗起到了显著的作用，然而很快，多数病人对这些药物不可避免地出现耐药性（Drug resistance）。

耐药性的出现是由药物对细胞生长施加的进化压力驱动的，可能涉及多种机制。之前，对抗病毒和抗菌素的广泛研究为理解耐药机制的研究积累了经验。例如，抗病毒药物的耐药性通常是由于靶蛋白的突变而产生的，这种突变可以阻止药物结合。因为病毒种群由一系列相关基因型组成(也称为病毒准种或群)，由于复制过程中的高突变率，抗性病毒的选择可以很快发生。在细菌中，细菌的水平基因转移可以通过选择基因元件来促进药物的修饰并使其失效(例如，β-内酰胺酶水解β-内酰胺抗生素)，从而产生获得性耐药性。除了上述机制外，在肿瘤细胞中，促进耐药的机制还包括通过上调促进药物代谢的外源性途径来减少细胞药物丰度，以及增加导致非特异性多药耐药（Multidrug resistance, MDR）的基因表达等。综上，病人发生耐药的机制可能是来自于多种因素的复合结果，亟需新的策略来解决耐药的出现，并开发出具有长期效益的治疗方法，而通过药物化学和化学生物学的创新将有助于帮助解决耐药问题。

一、设计不同结合模式的抑制剂

抗癌小分子耐药性的出现，往往来源于编码靶蛋白(如BCR-ABL、EGFR或ALK)的基因突变，从而阻断或减少小分子药物在靶标原本位点上的结合。这种类型的癌细胞耐药的一个重要例子是激酶活性位点的看门（Gatekeeper）残基突变，从而阻止作用于该位点的药物结合。例如，在BCR - ABL驱动的白血病中，经常出现T315I 突变，阻止了针对ABL1激酶活性位点的不同竞争性抑制剂结合，如imatinib（伊马替尼）或dasatinib（达沙替尼）。类似地，ALK1的一个突变L1196M，会使得crizotinib（克唑替尼）发生耐药。科研人员通过发现在同一位点不同结合模式的分子来克服这类耐药。例如，后续开发的三代ALK抑制剂都结合在ALK活性位点，但它们可以通过不同结合模式与活性位点特异残基相互作用来实现选择性和效力，从而克服耐药性。

对病人进行药物药效和耐药的临床前测试（Combining preclinical analyses of resistance and compound testing）是目前预测和克服耐药性的较成功方法。作为第一代ATP竞争性抑制剂，entrectinib和larotrectinib用于治疗由编码原肌凝蛋白受体激酶（TrkA, TrkB和TrkC）的NTRK1-3基因病变驱动的癌症。与其他分子靶向治疗一样，这些药物在使用过程中很快就产生了获得性耐药性。对患者肿瘤样本细胞培养后的耐药分析显示，larotrectinib和entrectinib的耐药主要来自于激酶核苷酸结合口袋前面暴露于溶液的loop（例如，TrkA中的G595R和G667C和TrkC中的G623R）和DFG motif（例如，TrkA中的G667C）上的突变所致。于是，研究人员开展了针对这些突变等位基因的化合物筛选，发现基于larorectinib骨架的一系列13元环分子，可以有效地阻断抗larorectinib和entrectinib的Trk等位基因的活性。其中一个分子，LOXO-195，已经迅速进入临床试验。在对larorectinib产生耐药的患者治疗中，LOXO-195可使得大多数患者的肿瘤消退，说明临床前耐药性分析对于设计提高疗效的药物发现是有价值的。

二、设计以半胱氨酸为靶点的共价抑制剂

共价抑制剂是克服耐药性的另一种化学策略。这类抑制剂中存在着亲电基团（如丙烯酰胺、环氧化合物或α-卤羰基），可与位点中的亲核残基（如半胱氨酸或赖氨酸）形成共价键。已知许多药物靶标的活性位点中都含有可用于抑制剂设计的天然半胱氨酸，例如，长期使用gefitinib（吉非替尼）或 erlotinib（厄洛替尼）治疗EGFR驱动的癌症时，会导致病人发生EGFR-T790M突变从而耐药。虽然该突变并不阻止这些药物在活性位点的结合，但其与ATP底物结合的亲和力增加了，这被认为是导致耐药的原因。为了解决这一问题，研究人员发现EGFR在ATP结合位点的入口处存在一个半胱氨酸残基，与该残基形成共价键的亲电化合物（C797）可以有效地阻断EGFR- T790M的活性，例如共价抑制剂如osimertinib（奥希替尼）或WZ4002等。共价抑制剂与可逆抑制剂相比，可以显著增加抑制剂在位点的占用率，且与T790M的蛋氨酸侧链之间的相互作用也可以帮助减少非癌细胞中由于抑制野生型EGFR而产生的不良副作用。这些进展说明了以蛋白活性位点的天然半胱氨酸为靶点来设计共价抑制剂能够克服对靶向抗癌药物的耐药性。

三、设计针对变构结合位点的抑制剂

尽管可以部分缓解耐药性，上述ATP竞争性抑制剂或共价抑制剂的效力依然可能会因延长药物治疗时出现的突变而减弱。一种更加优势的策略是针对蛋白中非活性位点的变构位点（或口袋）设计抑制剂。与ATP结合位点相比，这些口袋的保守性更低，靶向它们的抑制剂可能具有较高的选择性，并具有额外的有利性质（例如，更长的靶向停留时间）。例如，针对Abl1激酶肉豆蔻酸口袋的变构抑制剂可以有效地阻断激酶的活性。此外，针对肉豆蔻酸口袋的变构抑制剂，如ABL001(asciminib)，对活性位点突变耐药性肿瘤也有效果。因此，针对蛋白变构位点进行药物研发是最终彻底克服耐药性的可能策略之一。

当然，突变也可能出现在变构口袋中，并导致对这些变构抑制剂的耐药性。对阿西替尼获得性耐药的研究表明，Abl1激酶肉豆蔻酸口袋的突变（该抑制剂的拟结合位点）可以产生耐药并阻止药物的结合。在这种情况下，阻断asciminib结合的突变与那些对活性位点抑制剂产生耐药性的突变截然不同。变构口袋突变的BCR-ABL基因型并不会显著改变激酶活性，而且可以被活性位点抑制剂如伊马替尼或达沙替尼所阻断。临床上正在进行的研究表明，结合变构和活性位点抑制剂来阻断细胞中的BCR-ABL可以有效减少甚至防止抗性的获得。进一步的研究将确定这种药物组合是否也能限制患者对靶向BCR-ABL药物的耐药性的发展。

四、设计可结合多位点的化合物

PI3K–Akt-mTOR通路在人类癌症中经常过度激活，其中mTOR是药物研发的靶标之一。在mTOR抑制剂的临床试验中，不论是在rapamycin结合位点上的rapalogs还是ATP结合位点上的TOR激酶抑制剂（TOR Kinase inhibitors, TORKis）都诱导相应位点突变产生耐药性。例如，FRB结构域（FKBP12-rapamycin-binding domain）上的突变（如A2034V或F2108L）可阻止rapalog这类抑制剂结合，从而使患者对everolimus（依维莫司）产生耐药性。此外，位于远离ATP结合位点的激酶结构域~ 15Å的M2327I突变虽然不会阻止化合物的结合，但能对TOR激酶抑制剂AZD8055产生耐药性。

最近，为了解决这两类mTOR抑制剂的耐药问题，研究人员设计了一种二价化合物，称为RapaLink-1，通过在rapalog和TORKi之间加入一个连接链，使得该化合物可以同时与rapamycin位点和ATP结合位点相互作用。细胞研究表明，RapaLink-1可以通过阻断mTOR信号抑制增殖，并提示化合物结合在靶标的两个口袋。有趣的是，RapaLink-1对mTOR在FRB和激酶结构域的突变也具有抑制作用，克服了突变对rapalogs, TORKi及其组合的耐药性。像RapaLink-1这样的二价化合物还可以提高对所选靶标的选择性，而且类似的方法对其他靶标的双位点药物设计也带来了积极的思路。

五、设计PROTACSs克服耐药

PROTACs是指一类利用靶向诱导蛋白降解的双功能分子，可以抑制靶标功能，也可以靶向癌症中靶标的耐药突变，被认为是一种很有前途的策略。PROTAC分子结构上由“靶蛋白配体-连接子-连接酶配体'三部分组成，其中连接酶配体可以招募E3泛素连接酶，如von Hippel-Lindau（VHL）或cereblon（CRBN）连接酶。PROTAC分子中的连接酶配体通过共价连接子连接到与靶蛋白作用的配体上。通过两端的配体，PROTAC分子，靶蛋白和E3连接酶可导致三元复合物的形成，促进E3连接酶对靶蛋白的泛素化和蛋白酶体对泛素化靶蛋白的降解。然而，为了结合两个不同的蛋白，必须精确地调整PROTAC浓度，以避免在高浓度下与靶蛋白或E3连接酶形成无效的二聚体，从而阻止三元复合物的形成（hook effect）。除了复杂的药理学，开发PROTACs的最适连接子也很困难。有趣的是，当降解的泛素化蛋白释放出PROTAC分子时，PROTAC分子可以与目标蛋白的另一个分子结合，并重复降解循环。这种作用模式不同于常见的抑制剂靶标结合占位驱动的药理学，后者可能需要高剂量的抑制剂才能有效地阻断靶标的活性。与可逆抑制相比，靶向降解的另一个优势是对靶点的持续封锁时间更长，因为其功能和活性只能通过蛋白的重新合成来恢复。

使用PROTAC方法目前已被证明适用于多种癌症蛋白的降解（例如，BCR-ABL, EGFR或BTK）。最近的研究还表明，PROTACs可以克服这些靶标突变后产生的耐药性。例如，BTK的耐药突变通常是由丝氨酸（C481S）取代活性位点半胱氨酸残基而产生的，这会减少了共价抑制剂ibrutinib的结合。基于ibrutinib的PROTACs（如MT-802），尽管效力较低，但仍然可以与突变蛋白结合，可以诱导耐药型BTK的降解。这提示利用PROTAC方法可能可以靶向抗肿瘤药物的耐药等位基因。在靶标上的耐药突变完全阻止原有分子结合的情况下，可能需要针对蛋白上的变构位点PROTACs来提供另一种降解模式（例如，BCR-ABL的变构位点）。

六、通过使用药物联用克服耐药性

联合疗法（Combination therapy）是一种成熟的癌症治疗临床方法，也可以帮助解决正在出现的耐药性。使用多种化疗药物的混合疗法已经成为一种成功的癌症治疗方法，因为药物组合比单一药物具有协同作用并提供更有效的抗癌结果。利用非重叠耐药谱和合成致死率原则来帮助克服耐药。

对药物的耐药通常是由于药物靶点的基因变化（例如，点突变、缺失或表达调控错误）引起的，对以不同蛋白或结合位点为靶点的药物组合产生耐药需要多种变化。然而，鉴于多个基因变化（如单点突变）在单个细胞中同时发生的可能性较小，因此使用具有非重叠耐药突变谱的药物组合（例如，针对蛋白质上“正构-变构”的位点组合或针对不同的蛋白靶标）可能是限制和防止耐药出现的强大策略。

未来展望

耐药是靶向药物发展过程中的重大科学问题。随着药物化学与化学生物学中一些创新技术的出现，使得开发具有更好疗效并提前应对耐药性出现的药物研发策略得以开展。在这些方法中，同时靶向一个蛋白上的正构活性位点和变构位点已被证实可以减少耐药性的出现，因为阻止化合物结合的多个突变的发生几率较小，是解决耐药的最有潜力方案之一（“张健课题组发表“变构-正构”联合的抗耐药策略”）。同时，计算药物设计/机器学习方面的进步会可能识别具有克服耐药可能的不同药物组合，PROTACs和多位点结合分子的发展也会帮助开发可以减少甚至防止耐药出现的药物。这些新技术将有助于实现癌症靶向治愈的希望。

参考文献

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资源：