中国首个NGS检测试剂盒获批，速速学习基因精准治疗，不然你就out了
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最近对国内精准医疗行业最令人兴奋的就是，国家药品监督管理局于7月23日颁发了意义深远的 “肿瘤NGS第一证”，即批准广州燃石医学的高通量检测试剂盒 “人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）”的三类医疗器械产品的注册。除市场上已出现的针对单个基因的传统技术试剂盒，二代测序目前没有试剂盒。所以该产品成为中国首个获得CFDA批准的NGS肿瘤多基因检测试剂盒。那么NGS检测试剂盒和传统的单基因检测试剂盒的区别究竟是什么？目前NGS检测方法在精准医疗的临床应用的价值又是什么呢？
NGS检测是什么？
对于NSCLC，目前的有效应用靶点已经扩展到8-9种之多，但是已进入医院的传统技术试剂盒都是单基因的检测试剂盒，不能满足临床同时检测多基因的需求。其次两种基因检测试剂盒依托的检测方法也不一样，NGS检测试剂盒是通过高通量测序，一次性的检出其中的突变、插入缺失、融合（重排）等不同种类的DNA变异。而传统的检测试剂盒是通过PCR，FISH等传统一代检测方法进行单基因已知位点的分析。
目前基因检测的手段大致分为四类：PCR，FISH，基因芯片，基因测序。下图比较分析这4类分子诊断方法，每个诊断方法的特点也梳理如下：
简单地来说，NGS的技术原理是基于探针捕获的方法，通过预先设计的探针来抓取涵盖目标区域的DNA片段，之后通过对这些片段所形成的文库进行高通量测序，一次性检出其中的突变、插入缺失、融合（重排）等不同种类的DNA变异。
与PCR等传统方法相比，NGS最大的优势有三点：
①不局限于已知的突变热点，以往大家都认为这对于耐药阶段的检测尤为重要，但事实上对于初诊患者来说，罕见位点的有效覆盖也变得越来越有价值；
②可以进行多基因多种变异形式的平行检测，随着靶向药物的选择越来越多，平行检测替代顺序检测的模式演化会是未来的必然；
③使得检测数据的标准化与深度分享更为可能，NGS检测对于人工判读的依赖性远低于大多数的传统方法，而NGS数据结构化的程度和其中承载的信息丰富度远胜传统的分子检测方法，这两个特点的结合使得它可以更方便地在医生间和医院间实现分享，体现检测大数据对于精准医疗的推动力。
下面透过两个案例，去体会NGS在肿瘤治疗中的神奇魅力。
案例一
2016年N Engl J Med报道了一例ALK阳性的NSCLC患者，经历了一代ALK抑制剂、二代甚至到三代ALK抑制剂治疗后，竟然又回归了一代ALK抑制剂的治疗。
患者，女，52岁，ALK重排晚期NSCLC患者
治疗过程：
● 一线克唑替尼治疗，缓解18个月。
● 腹部淋巴结活检发现ALK C1156Y突变，对克唑替尼耐药，改用ceritinib治疗。
●使用ceritinib 5周后新发多个肝部病灶。患者使用热休克蛋白90抑制剂（AUY922）治疗，疾病迅速恶化。
● 之后，使用卡铂联合培美曲塞治疗，缓解6个月。
● 在化疗进展后，患者再次使用克唑替尼治疗，但是没有反应。
● 患者入组第三代ALK抑制剂——lorlatinib的I期研究，5周后显示肿瘤缩小了41%，缓解持续8个月。随后，CT显示肝部病灶恶化。
● 肝部病灶恶化后，行肝部病灶活检（第3次活检）发现C1156Y-L1198F双突变，且两者突变频率相似，提示这两个突变发生在同一等位基因上，即发生在同一细胞内。L1198F突变导致Lorlatinib耐药，但是对克唑替尼治疗敏感，患者再次接受克唑替尼治疗，肿瘤迅速缓解，肝功能恢复，肿瘤缓解长达6个月。
案例二
吴一龙教授团队的文献报道了NSCLC患者在一代EGFR抑制剂耐药后，4次耐药，跟着4次基因检测，不断地在基因检测中寻找最佳治疗方式的案例。这是第一次在非小细胞肺癌患者中检测到MET基因的D1231Y突变。
该患者，女性，44岁，IV期肺腺癌
治疗过程：
●第一次基因检测发现L858R突变，一线使用吉非替尼治疗，
●进展后，第二次基因检测发现T790M突变，换用奥希替尼治疗，缓解持续19个月，然后出现右肾上腺转移进展而耐药。
●第三次基因检测即液体活检，发现MET基因扩增突变，伴有EGFR基因L858R、T790M突变，所以采用奥希替尼联合克唑替尼（250mg，每天两次）治疗，患者肺部病灶获得了部分缓解，90%的腹膜后淋巴结和右肾上腺也减小。但3个月后，病情复发， CT扫描显示右肾上腺病灶增大，双侧肺部和腹膜后淋巴结增多，伴有胸腔积液增加。
●患者接受了第四次基因检测，即第二次液体活检，发现MET基因的D1228N/H，Y1230H和D1231Y突变（新的突变，之前也未见有报道），伴有T790M突变。患者开始使用卡博替尼（XL184，每日80mg）联合奥希替尼进行治疗。一周联合用药后，疗效显著，患者的呼吸困难和不适的症状得到缓解，可以下床活动，胸部X光片检查显示左侧胸腔积液减少，双侧肺结节缩小。但是一个月后，患者病情PD进展，床边胸部X光片显示双侧肺部有新的病变。
●第五次基因检测，即第三次液体活检发现D1228N突变，而其他三种突变消失，D1228N突变从44%增加到65%。可惜的是针对仅有MET D1228N突变，如何用药尚未得知，期待后续治疗进展。
NGS在临床的广泛应用价值
1.晚期初诊方案的制定需要NGS检测
目前在肺癌NCCN指南中，针对于晚期腺癌以及部分鳞癌患者是推荐进行基因检测的，一旦有有效的靶点突变，特别是EGFR/ALK/ROS1，靶向治疗是优于化疗及其他治疗的。而随着基因检测的发展，肺癌目前的有效应用靶点已经扩展到8-9种之多。如下表，虽然其中并不是所有靶点都优先考虑使用靶药，但靶药的存在为这类患者提供了一种多样的治疗手段。靶药高效低毒、口服使用的优势也让患者痛苦感明显减少。但一次性将这些靶点同时检测，一代的检测方法很难做到或流程复杂，而NGS一个小小的panel，一块组织或一管血即可搞定。同时有些检测公司提供的大型PANEL,包含几百种基因，基本能把目前研究的相关致病基因都检测到，这又大大增加了发现可用靶点的可能性。为一些不能承受放化的患者带来希望。还需要强调的一点是，即使一类基因突变如EGFR突变，也是分不同的突变形式，如常见突变L858R，如罕见突变L861Q，如特殊突变20ins，这些突变的靶药是非常不同的。而NGS可以广泛检测EGFR18-21外显子上的所有基因，精准到具体的位点及形式。这是一代不可handle的。
除此，具有EGFR突变的早期患者采用TKI靶药术后辅助的研究也获得阳性结果，相信靶药的使用空间也将逐渐增大。
除了肺癌，其他癌种一样需要NGS的使用。如在靶向药荒芜的卵巢癌腹膜癌中，BRCA突变是新型的也是唯一的治疗性靶标，且其在上皮性肿瘤的发生中较为频繁，50%的高级别浆液癌都具有这类突变。因此此类患者需积极检测，如果有阳性突变，靶药PARP抑制剂如奥拉帕尼、尼拉帕尼等即可用上，增加一种有效的口服治疗。特别在维持治疗上优势明显，一般患者化疗后只能维持5-6个月不复发，但如果具有BRCA突变，采用靶药维持的，可维持19个多月不复发，口服用药，方便高效。因此，在国外（欧洲、美国等国家）著名的妇瘤权威机构同意推荐卵巢癌、输卵管癌和腹膜癌都需要检测BRCA。而BRCA突变有一个特点，是散发性突变，我们经验性选取一些位点检测是无法覆盖的，因此只有NGS二代才能做到。而意义更为广大的是，BRCA代表的一类DNA修复缺陷基因包含很多种，而BRCA的突变在其他实体瘤种特别是乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌中都有一定的突变率，这种源于基因形式的治疗理论意义广泛。
2.一代靶药耐药后的处理
小编在前天的汇总文章中《肺癌八大基因耐药处理》中也展示了各种靶药的耐药处理，而其中，继发耐药突变导致的一代靶药结合不稳或无法结合位点是最重要的耐药原因，因此有效的发现继发突变，采用相应的靶药对抗，就能很好的逆转。另外，第二大原因旁路激活即其他基因突变如MET，也有很好的靶向解决之法。因此在耐药的关卡处进行二次甚至三次基因检测，广泛精准的基础上发现继发突变是NGS的优势。
另外重要一点不部分患者不愿接受第二次组织穿刺，而抽取外周血提取血液中ctDNA进行基因检测的NGS血检已经发展的非常成熟，多项研究证实，相比组织，NGS血检敏感性和一致性最高(均超过70%)，敏感性也在90%以上。而严格专业的质控会让这些指标接近完美。
3.未来发展方向之一：动态监测、预测转归
近日，由医学科学院肿瘤医院王洁教授及燃石医学领衔的前瞻性临床研究——BENEFIT研究的成果今日在Lancet Respiratory Medicine杂志（影响因子21.466）在线发表。
研究运用了ddPCR及NGS两种方法对血液样本进行检测，其中NGS方法使用了燃石医学的朗清™168基因panel。
结果在证明血检NGS对肿瘤治疗的指导地位外，还证实以下两个结论：①通过对ctDNA的定量分析发现，在治疗后的监控期间，ctDNA曾经出现过全阴（无法检出）的患者，相对于ctDNA始终可见的患者，PFS具有显著的优势；②通过基于NGS的ctDNA多基因平行检测，可将携带EGFR突变的患者进一步细分三组，：
第1组患者仅携带EGFR敏感性突变，
第2组同时具有敏感性EGFR突变和TP53、RB1、PTEN等肿瘤抑制基因突变，
第3组除EGFR敏感性突变还携带其他驱动基因变异（如MET, ERBB2, KRAS, BRAF, RET or ROS1) 和/或抑癌基因的变异(TP53, RB1, and PTEN)。
结果提示，仅携带EGFR敏感性突变的患者疗效最佳，各组相应的PFS分别为13.2 个月,9.3 个月以及4.7 个月。这意味着，在一线EGFR突变阳性这一有明确靶向用药策略的人群中，基线的突变谱全景依然具有重要的临床价值。
而，动态的观测基因的变化预测疗效转归在部分患者身上也得到验证。
未来NGS血检这把利剑如何应用让人冲满期待。
4.免疫治疗的疗效预测
随着O药和K药在国内加速上市，免疫治疗成为普通医患可接触的治疗，纵使神传种种，也非万能药。优选最合适患者是不变的主题。研究3年来，除了PDL1这个非绝对预测指标外，通过NGS基因检测的肿瘤突变负荷TMB也是另一比较成熟的预后指导Biomarker。TMB越高，说明突变越多，异型抗原合成越多，免疫细胞越能识别并活跃杀伤。因此高TMB的患者免疫疗效越好，这一现象被众多试验均以证实。例如，非小细胞肺癌和小细胞肺癌都有成功分层的研究结果。
而不同肿瘤其实本质上也有TMB高低之分，也造就了适合免疫治疗和不怎么合适免疫治疗的癌种之差。
5.肿瘤治疗新方向：以基因为指引的无关癌种类型的用药
小编尤记，在去年肿瘤疯狂进展的一年，仍有2件研究让大家刷了屏。一个是K药获批用于具有MSI-H/dMMR的所有实体瘤患者；另一个是FDA授予entrectinib治疗NTRK融合的成人和儿童实体瘤的突破性疗法称号。虽然两个进展受益的人群没有那么广泛，但似乎提示肿瘤界一个不争的事实：肿瘤治疗也可以不按癌种走，而按基因走。将来这个方向的药物研发队伍是否会壮大，非常期待。
由此，我们可以看出NGS测序在肿瘤的精准治疗中发挥重要作用，希望燃石的NGS检测试剂盒可以很快涉及其他瘤种，让更多的肿瘤患者可以获益与此！
参考文献
1.Resensitization toCrizotinib by the Lorlatinib ALK Resistance Mutation L1198F
2.Kang J, Chen HJ, Wang Z, et al. Osimertinib and cabozantinibcombinatorial therapy in an EGFR-mutant lung adenocarcinoma patient withmultiple MET secondary-site mutations after resistance to crizotinib.J ThoracOncol. 2017 Nov 8. pii: S1556-0864(17)32874-5.
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