单细胞测序鉴定银屑病的致病细胞亚群

文章信息

文章题目:Single-cell RNA sequencing of psoriatic skin identifies pathogenic Tc17 cell subsets and reveals distinctions between CD8+T cells in autoimmunity and cancer
期刊:Journal of Allergy and Clinical Immunology
日期:2021年6月
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2020.11.028

摘要

牛皮癣是一种IL-17 驱动的炎性皮肤病,自身免疫原诱导的CD8+T细胞被认为是主要的作用细胞。

本文中主要对健康皮肤、银屑病皮肤里的CD8+T 细胞进行单细胞测序。

  1. 鉴定出银屑病皮肤中富集的两个Tc17细胞亚群,代谢不同,表达CXCL13。这个CXCL13可以作为 银屑病严重程度的一个指标,在银屑病和健康转录组的支持向量机分类器中实现了与 IL17A 相当或更高的准确性。
  2. 将银屑病Tc17细胞亚群与黑色素瘤浸润的 CD8+T 细胞进行比较,发现这些细胞中细胞因子、溶细胞和代谢转录活性的上调,这与衰竭程序不同。

结论:使用组织中的高分辨率单细胞分析,我们发现了银屑病和健康皮肤中 CD8+T 细胞的异质性,包括与疾病严重程度相关的2个未耗尽的 Tc17 细胞亚群。

方法

  • 消化
    取下来的皮肤,放在4℃PBS中。去掉毛发、皮下组织后,过夜消化:5% CO2 in RPMI 1640 medium containing Collagenase Type IV (LS04188, Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ), DNAse (DN25-1G, Sigma-Aldrich, St Louis, Mo), 10% FBS, 1% HEPES, and 1% penicillin/ streptavidin.分选出CD8+T细胞
  • 建库
    SMART-Seq v4 Ultra Low Input Kit ,Illumina HiSeq 4000
  • 数据处理
    ①  STAR 2.4.2a,GRCh38,GENCODE 25,HTSeq 0.6.1p1,R 3.4.2, GSE146264
    ② 数据过滤:(<100,000 mapped reads, <1,000 mapped genes, >25% reads mapped to ERCC, or >25% reads mapped to mitochondrial genes).

结果

细胞聚类

质控后的细胞:

  • 银屑病:2919个CD8+T细胞,
  • 正常皮肤:1656个CD8+T细胞。

分11个亚群。clusters 0, 1, 2, 4, 5, 7, 8在正常皮肤,银屑病皮肤中都有。cluster3大部分来自正常皮肤,cluster6和10绝大部分来自银屑病病人。总结11个病人的样本中,11个病人富集cluster6,8个病人富集cluster10。

银屑病皮肤中的炎性CD8+T 细胞亚群

接着研究银屑病皮肤中的CD8+T 细胞。看了已知的T细胞marker在各群的表达。如下图A。健康皮肤多的亚群,如cluster1,2,3,5,炎性子表达的少。然后又看了不同亚群细胞周期基因的表达情况。cluster8处于相对静止的状态。

银屑病皮肤细胞群多的cluster0,4,6,7,10,炎性特征比较明显。cluster9 高表达TNF,IFNG。cluster0高表达GZMK,GZMA,KLRG1。cluster4高表达CCR7, KLRG1,CXCR3.cluster 6和10高表达IL17A.

Tc17细胞亚群表达CXCL13

对银屑病人中富集的cluster6,10格外感兴趣。发现他们都高表达CXCL13,下图图A。CXCL13接到B细胞招募到淋巴组织。且CXCL13的高表达与IL17A 有相关性,下图图B。对银屑病皮肤样本染色CXCL13,IL17A,发现二者共定位。

接着作者用了四个公共数据库的数据证明了CXCL13在银屑病皮肤中的高表达。

  • ①39个病人的临床试验中CXCL13在血清中的浓度更高,图E
  • ②17个病人银屑皮肤的CXCL13的基因表达更高,随着anti-IL13的治疗,表达量下降。图F。
  • ③ bulkRNAseq,82个正常病人,92个银屑病人的皮肤测序,使用 CXCL13 表达对健康和银屑病皮肤样本进行支持向量机分类,无论是单独使用还是与 IL17A 结合使用都实现了高度的准确性,图G
  • ④ 在58个银屑病和64个正常皮肤的芯片测序中也发现了类似的结果。

比较银屑病人Tc17 亚群和黑色素病人浸润的CD8+T细胞

之前的文献中有对黑色素瘤浸润的T细胞失能打分。作者把方法应用在自己的数据集,发现Tc17的两群cluster6和10得分最高,cluster1,3,8得分最低,图A。图B表示了共抑制receptor的表达。图C 是代谢打分。图D,银屑病cluster6和10,细胞毒性T细胞通路变道上调,而exhausted 肿瘤浸润的淋巴细胞里没有。

Tc17亚群之间的发育关系

最后,分析了TCR-spining reads,以对健康皮肤和银屑病病变中的 CD8+T 细胞之间的克隆型扩增和分化动力学进行有限的比较。在 7304 个单细胞转录组的初始数据集中,研究者通过组装它们的 TCR 跨越读数重建了 4908 个 CD8+T 细胞(每个受试者平均 62% 的输入细胞)的 TCR 库。在每个受试者中,这些细胞代表平均 224 个独特的“克隆型”,此处将其定义为具有完全匹配的 TCR 序列集的细胞组推断的 CDR3 区域的比较。

细胞群之间共享的 TCR 序列和克隆型提供了产生2种表型不同的 Tc17 细胞亚型的分化过程的证据。从每个 CD8+T 细胞群中,细胞群之间共享 43 到263个TCR(即,可以在同一受试者的不同细胞群中发现的TCR序列)。尽管通常在所有其他集群中检测到给定cluster的共享 TCR(图 5,A 和 B),但它们在每个其他集cluster中的平均比例显着不同(Kruskal-Wallis P < 10-4 对于共享的 TCR 集所有集群)。特别是,cluster10 的共享 TCR 被检测到最频繁(平均而言,在cluster 6 [Mann-Whitney P < .001] 中,在较小程度上,在cluster 4 所代表的激活亚型中 [Mann-Whitney P < .04])。反过来cluster 6 的共享 TCR 最常出现在cluster 4 中(Mann-Whitney P < .04),这表明这些cluster中的细胞可能来自从cluster 4 到cluster 6 再到cluster10. 与这种发育关系一致,在cluster 10 中的 13 种克隆型中也存在于其他cluster中,在cluster6 中也检测到了 8 种(62%)。

讨论

TCR 和表达数据阐明了银屑病病变中炎症亚型的分化。直觉上,cluster 0、4、6 和 10 之间共享的 TCR 序列和克隆型将与由cluster 4 代表的激活的皮肤归巢 CD8+T 细胞分化为任一细胞毒性效应物(由簇0代表)的模型一致。) 或 Tc17 细胞效应器(由cluster6表示),根据先前的观察,产生 IL-17 的 CD8+T 细胞可以产生体外产生IL-22 的亚群。

小结

本文内容不多,杂志期刊影响因子较高。作者通过其他数据库的数据交叉验证自己的测序结果。显得结果可信。

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