文献详解丨听说这个国自然热点随随便便就能发篇6+文章
小编听到说别人在一个月内利用“热点”发表了3篇5+的文章，比如铁死亡，免疫浸润，丝切蛋白等等。那么热点要搭配哪些分析流程才能发高分？今天，就围绕近期热点——铁死亡，给大家整理一个热点的分析思路。文献题目：肾透明细胞癌中与PD-L1和免疫浸润相关的铁死亡因子的综合分析。
Ferroptosis是一种依赖铁的程序性细胞死亡过程，其特征是自由基的产生和脂质过氧化物的过度积累。而肾透明细胞癌 (ccRCC) 是对铁死亡敏感的肿瘤类型之一。此外，免疫疗法也成为转移性 ccRCC 治疗的标准支柱。而铁死亡是否影响 ccRCC 中的肿瘤免疫微环境仍不清楚。这篇文章全面探索了铁死亡与CARS免疫检查点的相关性。主要分析及结果分为以下7个部分：
铁死亡因子在癌症中的调控中起着很关键作用。先了解本文研究的铁死亡因子有多少个。借鉴这篇文献的内容（PMID：32629423），作者研究了24个铁死亡因子。其次在TCGA数据库中下载肾透明细胞癌（ccRCC，也叫KIRC）数据，包括530个ccRCC组和72个正常对照组。挑选出24个铁死亡因子在其中的表达量数据。
结果1：在与正常组对比下，癌症疾病组中属于上调的的铁死亡因子有CDKN1A、HSPA5、EMC2、SLC7A11、MT1G、HSPB1、FANCD2、SLC1A5、RPL8、LPCAT3、DPP4和CARS；下调的有NFE2L2, GPX4, CISD1, FDFT1, NCOA4, GLS2, CS, ATP5MC3, ACSL4（A，B）。此外，还分析了铁死亡因子间的相关性，发现在ccRCC中有重要预后作用（C）。
这步分析主要是证明铁死亡因子的表达在ccRCC组和正常组之间具有差异。
这里使用R软件的Consensus Cluster Plus软件包对疾病组（530个ccRCC组）进行一致性聚类分析。A,B图可知当k为2时，有最优聚类稳定性。所以530个ccRCC聚类成两组：444组ccRCC（聚类1） vs 86组ccRCC（聚类2）。继续观察24个铁死亡因子在疾病亚型分组中的表达差异。
结果2：聚类1中，20个铁死亡因子高表达（C）。且聚类1与较低的肿瘤分期和肿瘤分级优先相关，该聚类中的患者具有良好的总生存期和无进展生存率。而聚类2中，HSPB1和GPX4低表达，且在两个亚组间表达无差异（C）。
通过一致性聚类和预后分析，两种亚型之间存在显著的异质性。
分析3：PD-L1表达谱分析
及ccRCC亚型免疫浸润评估
前面分析发现铁死亡因子在ccRCC中有不同的表达谱，此外，还发现这些因子与PD-L1（是一个免疫检查点基因，其表达与多种癌症类型的不良预后密切相关）表达也相关。抗PD-L1抗体和铁死亡因子激活剂之间存在协同效应，在体外和体内均可抑制肿瘤生长。因此，通过评估PD-L1在两个亚组中的不同表达以及PD-L1与ccRCC中铁死亡因子的关系，来看一下到底PD-L1和这些因子是如何影响ccRCC的进程。
结果3：与正常组织和聚类2相比，PD-L1在ccRCC组织和聚类1患者中的表达水平分别明显过表达（A,B）。PD-L1与多数铁死亡因子(如ACSL4、CARS、NCOA4等)表达水平呈正相关，而与HSPB1、MT1G、RPL8、GPX4呈负相关(C)。
此外通过CIBERSORT数据库，评估了ccRCC中两组亚型的免疫浸润情况，并发现免疫浸润存在显著差异（D）。
结合上面D图和下图，可以看到聚类2有着更高水平的activated NK cell，memory B cell，CD8+ T cell,，Tregs和 T follicular helper cell（A-C）；聚类1中则CD4+ memory resting T cell，naive B cell，neutrophil，monocyte，M1 macrophage，和M2 macrophage 等免疫细胞的浸润水平较高 (D–F)。之后使用R包-Cluster Profiler进行GSEA分析，说明了ERBB和JAK_STAT信号通路可能与ccRCC两种亚型的肿瘤免疫微环境差异有关（G）。
主要分析了铁死亡因子与ccRCC中PD-L1表达水平和免疫细胞浸润的关系。
分析4：确定主要铁死亡因子
并通过数据库+湿实验结合验证其表达
上面明确了主要调控通路，那么还需明确与ccRCC预后不良和PD-L1表达相关的主要铁死亡基因，这就发现了CARS这个因子（A）。它既高表达又与PD-L1表达正相关，还是唯一一个聚类1中高表达的不良预后因子（B）。
进一步证实CARS可以作为主要铁死亡因子。分析TCGA与GEO的数据可知，CARS在疾病组中也呈高表达趋势（C-E）。
结果4：最后，结合湿实验验证，检测了22对ccRCC和正常组织中ccRCC细胞株和正常肾细胞株中的CARS的表达情况，更加确信CARS在ccRCC中相对正常组织是高表达（F-H）。
表明CARS在ccRCC中的转录和翻译水平上都有高表达，具有预后价值。
接下来就是验证CARS的预后价值。结果5：发现CARS高表达组中的总生存期（OS）更差且生存率更低（A-C）。ROC曲线显示，与管家基因β-actin和GAPDH表达预测生存率的AUC值（ROC曲线下方的面积大小，AUC越大，检测方法真实性越高）相比，CARS预测到的AUC值明显更大。这表明CARS具有强大的预后能力。单因素Cox分析显示年龄、肿瘤分期，肿瘤分级，CARS表达都与ccRCC的OS显著相关(E)。此外，多变量森林图分析也显示，CARS表达(p = 0.047)是影响ccRCC患者预后的独立因素。
所以在ccRCC中， CARS高表达是一个显著独立的预后生物标志物。
确定了ccRCC中的主要铁死亡因子及其预后价值后，为了与突出本次研究的主题，还需解析CARS的表达与PD-L1及浸润的免疫细胞间的相关性。
结果6：Cluster Profiler包分析CARS高表达样本中的GO项和KEGG通路（A，B），选取与高表达CARS正相关的途径（GO与KEGG各有5条与其相关）发现：CARS可能参与了ccRCC的多种信号通路和肿瘤免疫微环境。相关性分析还显示CARS与ccRCC中PD-L1的表达呈显著正相关（C）。并通过CIBERSORT算法，发现高CARS表达组中，单核细胞、M1巨噬细胞、中性粒细胞增加，CD8+ T细胞、活化NK细胞、γ - δ T细胞减少（D，E）。
这一步研究了CARS表达与PD-L1及浸润性免疫细胞的相关性分析。
分析7：多种癌症类型中铁死亡调节因子
CARS的综合分析
最后，作者还考虑了CARS在其他癌症类型中的表达。
结果7:（1）分析了TCGA和GTEx数据库中10000多个肿瘤和正常组织样本中CARS的相对表达：与正常组相比，CARS在12种癌症类型中显著上调，13种癌症类型中下调(A)。也做了（2）单因素Cox回归分析CARS在这些癌症类型中的预后价值：13种肿瘤类型中CARS上调与较差的OS相关(B)。再然后就是相关性分析了：大多数癌症类型中，CARS与检查点相关基因的表达密切相关，尤其是PD-L1的表达(C)。
本文值得借鉴的分析点有：
作者围绕近期热点——铁死亡进行分析，首先选题就很吸引人。另外，结合免疫浸润评估，多层次分析肿瘤发展所参与的过程。其次就是分析过程了，前面一直做对ccRCC这种癌症的数据分析。文章的最后，补上了调控ccRCC的主要铁死亡因子在其他癌症中的表达及预后。由此可见，实验做出来的结果可信度蹭蹭往上涨。
文献出处：
Wang, S., Chen, S., Ying, Y., Ma, X., Shen, H., Li, J., Wang, X., Lin, Y., Liu, B., Zheng, X., & Xie, L. (2021). Comprehensive Analysis of Ferroptosis Regulators With Regard to PD-L1 and Immune Infiltration in Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Frontiers in cell and developmental biology, 9, 676142. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.676142