半胱氨酸耗竭诱导小鼠胰腺肿瘤铁死亡
铁死亡是一种细胞死亡的形式，由ROS的灾难性积累导致。在许多类型的肿瘤中，致癌信号升高脂质ROS的产生，并被氨基酸半胱氨酸衍生的代谢物抵消。本研究表明通过xc系统输入氧化半胱氨酸(胱氨酸)是胰腺导管腺癌(PDAC)的一个重要依赖性，这是癌症死亡的主要原因。PDAC细胞利用半胱氨酸合成谷胱甘肽和辅酶A，共同下调铁死亡。通过对基因工程小鼠的研究，发现xc亚基系统Slc7a11的缺失可以诱导肿瘤选择性铁蛋白作用，抑制PDAC的生长。这是通过给胱氨酸酶复制的，这是一种消耗半胱氨酸和胱氨酸的药物，证明了一种可翻译的手段，诱导PDAC的铁死亡。
为了研究半胱氨酸代谢在PDAC中的作用，测定了人PDAC细胞系在不同浓度胱氨酸或系统xC抑制剂咪唑酮erastin(IKE)的活力。在5个PDAC细胞系中的4个中，胱氨酸饥饿使细胞活力降低；通过添加亲脂性抗氧化剂Trolox在很大程度上阻止了这一点。IKE处理模拟了胱氨酸撤除的效应，快速杀死来自四个敏感PDAC系的大多数细胞，其方式在视觉上与胱氨酸饥饿相同。胱氨酸饥饿和系统xc均未诱导半胱天冬酶3裂解，这表明细胞死亡不是凋亡的。发现用去铁胺、铁抑素-1或N-乙酰半胱氨酸（NAC）共同处理人PDAC细胞可显著减少半胱氨酸耗竭导致的细胞死亡，而细胞凋亡或细胞坏死抑制剂对细胞死亡几乎没有影响。利用荧光探针C11-BODIPY，观察到在半胱氨酸耗竭引起的细胞死亡之前，脂质氧化（铁死亡的标志）大量增加；这是通过Trolox、Fer-1、NAC和DFO共同处理阻止的。相比之下，这些药物不能阻止半胱氨酸耗竭诱导的总ROS水平升高，这反驳了更普遍的氧化过程。从这些实验中得出结论，大多数PDAC细胞系依赖于半胱氨酸来阻止嗜铁细胞死亡。
图1.胰腺癌细胞需要外源性胱氨酸来避免铁死亡
为了解小鼠胰腺肿瘤是否依赖于系统xc存活，采用了基于KPC小鼠模型的双重组酶基因工程策略。发现逃逸的肿瘤通过聚合酶链反应表现出Slc7a11重组不完全的证据，并通过蛋白质印迹法恢复蛋白表达，这表明未重组的肿瘤细胞生长。在他莫昔芬处理的KPFSR肿瘤中，观察到大量具有脂滴样结构和间歇性巨线粒体的气球样上皮细胞病变，通常与坏死区域并列。这些病变没有表现出细胞凋亡或增殖标志物的改变。但显示了4-羟基壬烯醛(4HN)的积累，脂质过氧化的副产物，使其成为体内铁死亡的候选者。在他莫昔芬处理的KPFSR小鼠的非胰腺组织中未观察到病理，表明肿瘤选择性表型。他莫昔芬处理的KPFSR肿瘤TEM和油红O染色证实存在异常大的脂滴小滴。TEM还发现恶性上皮细胞线粒体结构畸变，这与之前的体外研究结果一致。最后进行了激光捕获显微切割和RNA测序，从KPFSR肿瘤中分离恶性上皮细胞。结果表明在三苯氧胺处理的KPFSR肿瘤中观察到的表型是组织学上可识别的铁死亡的体内表现。
图2.KPC小鼠Slc7a11缺失可诱导肿瘤铁死亡并延长生存期
他莫昔芬治疗的KPFSR肿瘤病变的组织病理学和免疫组化分析
为了研究额外的半胱氨酸衍生的代谢物是否有助于铁死亡的调节，通过使用13C标记的胱氨酸和通过质谱法测量标记的代谢物来追踪外源性胱氨酸的代谢。胱氨酸在24小时内转化为辅酶A(CoA)，未观察到牛磺酸、乳酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐通量。CoA及其衍生物辅酶Q10(CoQ10)均显示影响对铁死亡的敏感性。发现系统xC–抑制降低了CoA水平，增加了泛酸的水平，CoA合成中半胱氨酸掺入上游的代谢产物。而且用外源性CoA处理PDAC细胞可阻止IKE诱导的铁死亡，而用PANKi抑制泛酸激酶可使细胞对IKE敏感。用艾地苯醌（CoQ10的膜通透性类似物）或单不饱和脂肪酸共同处理可阻断BSO/PANKi--诱导的铁死亡，而饱和或多不饱和脂肪酸则不能，与之前IKE的观察结果相似。这些实验证明CoA和GSH协同调节人PDAC细胞的铁死亡。
图3.谷胱甘肽和辅酶a联合抑制可诱导人PDAC细胞的铁死亡。
最后寻找一种靶向胰腺肿瘤中半胱氨酸代谢的药理学手段。在体外，胱氨酸酶处理诱导了脂质氧化，降低了IKE敏感的PDAC系的活力。为了确定胱氨酸酶在体内对胰腺肿瘤的影响，用溶剂、低剂量胱氨酸酶或高剂量胱氨酸酶处理荷瘤KPC小鼠。观察发现嗜铁病变一般为4HN阳性，裂解的半胱天冬酶3阴性。最后另外4只KPC小鼠用超声观察其肿瘤生长情况。值得注意的是4个肿瘤均表现出稳定或消退，而历史溶剂处理对照从未稳定。得出结论半胱氨酸（胱氨酸）的治疗性耗竭可诱导小鼠Kras/p53突变胰腺肿瘤中的铁死亡。
图4.胱氨酸酶治疗可诱导KPC小鼠的肿瘤选择性铁死亡
越来越多的证据表明，某些癌症包括PDAC依赖于半胱氨酸代谢来避免铁死亡。在PDAC异种移植模型中，半胱氨酸耗竭对肿瘤生长几乎没有影响，这可能表明胰腺肿瘤的营养缺乏、缺氧微环境可能有助于在PDAC的基因工程小鼠模型中观察到的肿瘤选择性半胱氨酸依赖。尽管目前尚不清楚人PDAC是否也易受半胱氨酸耗竭导致的铁死亡的影响，但胱氨酸酶治疗代谢性疾病胱氨酸尿症的临床开发为未来转化这一概念提供了途径。
Thank you！