经典通路补点验证实验发3+分 / 开普饭

今天和大家分享的是2020年1月发表在Oncotarget and therapy（IF=3.337）上的一篇文章：“Biological and Clinical Signifificance of GATA3 Detected from TCGA Database and FFPE Sample in Bladder Cancer Patients”，作者利用TCGA数据库和FFPE组织样本发现了BLCA中的GATA3存在表达差异，通过KM生存分析和多因素cox证明了GATA3的独立预后价值，并建立了其与细胞周期调控和细胞增殖的关系，为膀胱癌患者提供了一个潜在的治疗靶点。

Biological and Clinical Signifificance of GATA3 Detected from TCGA Database and FFPE Sample in Bladder Cancer Patients

利用TCGA数据库和FFPE组织样本研究GATA3对膀胱癌患者的生物学和临床重要性

一、研究背景

TCGA-BLCA是排名第十位的常见恶性肿瘤，通常预后较差并伴随着高复发风险，因此寻找独立的BLCA预后标志物及其相关通路对完善其靶向治疗非常重要。在此前的研究中发现GATA3可以作为乳腺癌的独立预后标志物，其高表达可以抑制乳腺癌细胞的增殖；因此作者希望在本项研究中探索GATA3的表达与膀胱癌预后的关系，提供一个新的BLCA治疗靶点。

二、分析流程

三、结果解读

1、GATA3的表达差异鉴定

首先，为了证明GATA3与BLCA的疾病进展的关联，作者从mRNA和蛋白两个水平检测了GATA3在BLCA肿瘤组和对照组之间的表达差异。通过比较TCGA的364个BLCA样本和19个正常对照样本的GATA3表达水平，作者发现肿瘤组的GATA3在mRNA水平上呈现高表达（图1.A）；然而利用T24、UMUC3等4个BLCA细胞株进行的Western Blot实验发现，BLCA细胞的GATA3在蛋白水平上呈现低表达（图1.B）。作者证明了GATA3在BLCA中存在表达差异，为下文对GATA3预后价值的分析奠定基础。

图1.mRNA和蛋白水平的GATA3表达差异鉴定

2、GATA3与BLCA患者临床病理的关系

为了研究BLCA的不同临床病理特征（如：年龄、分期、亚型等）与GATA3表达水平的关系，作者分别对FFPE组织样本和TCGA患者队列的临床病理数据进行了统计分析。

FFPE队列：利用IHC（免疫组织化学）实验从107个FFPE样本中筛选出94个GATA3阳性样本（图2），并将他们按照免疫组化评分分成1+、2+、3+三组，并按照这个分组计算临床病理等特征的差异（表1）。其中：低肿瘤等级、肿瘤亚型为乳头状肿瘤、TNM分期1/2期的患者中GATA3的高表达具有统计显著性（Fisher检测p值分别为0.002、0.003、<0.001）

图2.对FFPE样本做GATA3的免疫组化实验结果

表1.FFPE队列按免疫组化评分分组的临床病理数据

TCGA：作者从TCGA数据库下载了完整的BLCA患者临床病理数据，按照标准化GATA3表达水平的中位数作为cut-off，将样本分为高表达组和低表达组，并按照这一分组计算临床病理等特征的差异（表2）。其中：低肿瘤等级、肿瘤亚型为乳头状肿瘤、AJCC分期1/2期的患者中GATA3的高表达具有统计显著性（Fisher检测p值分别为0.0057、0.001、<0.001）。

表2.TCGA队列按GATA3表达水平分组的临床病理数据

最后，作者为对TCGA队列的分析进行了补充，将所有患者按照AJCC分期的pT2期和pT3+4期进行分期，再按照这一分组计算临床病理等特征的差异（表3），发现在pT2组中，低肿瘤等级、肿瘤亚型为乳头状肿瘤的患者中GATA3的高表达具有统计显著性；而在pT3+4组中，只有肿瘤亚型为乳头状肿瘤的患者中GATA3的高表达具有统计显著性。

表3.TCGA队列按AJCC分期分组的临床病理数据

3、GATA3表达与患者预后关系

对TCGA和FFPE队列分别进行KM生存分析，发现在TCGA队列中，GATA3在mRNA水平上呈现高表达的患者预后更好（图3.A）；而在FFPE队列中，GATA3在蛋白水平上呈现低表达的患者预后更好（图3.B）

图3.两队列高低表达组KM生存分析结果

在得到GATA3与预后有关的结论后，作者又利用多因素cox回归分析（表4）和分临床亚组的KM生存分析（图4）对GATA3表达水平和其他临床预后因素的预后价值独立性进行了检测。对两队列的多因素cox回归分析结果显示：年龄、是否复发、GATA3在mRNA水平上的表达水平（TCGA队列）、GATA3在蛋白水平上的表达水平（FFPE队列）均为独立的BLCA预后影响因素。为了对多因素cox的结论补充验证，作者将FFPE队列分为：是/非乳头状肿瘤、高/低肿瘤等级、肌肉浸润组（缺少非肌肉浸润组患者样本）五个临床亚组，进行KM生存分析，发现GATA3蛋白表达水平在乳头状肿瘤、高肿瘤等级和肌肉浸润肿瘤三个亚组中有独立预后价值。

综合上述两步分析，作者证明了GATA3表达水平与BLCA患者预后有关，且在多数临床亚组患者中具有独立预后价值。

表4.两队列单/多因素cox分析结果

图4.FFPE对列分临床亚组的KM生存分析结果

4、GATA3表达与肿瘤表型关系

为了研究GATA3与BLCA的细胞凋亡和细胞周期变化两个表型的关系，作者利用流式细胞术检测T24和UMUC3两个细胞株的细胞凋亡（图6.A）和细胞周期各阶段的细胞数量变化（图6.B-C）。在此之前，为确保后续的一系列实验是有意义的，作者先对两细胞株是否成功转染了GATA3进行了验证，将用pcDNA3.1载体转染的细胞株与对照组进行GATA3表达水平的比较，发现前者的GATA3表达水平明显较高，说明GATA3成功转染到了T24和UMUC3细胞株中（图5）

在验证实验使用的细胞株中成功转染了GATA3后，作者利用流式细胞术，先验证了在两细胞株中GATA3的表达均不影响细胞凋亡（图6.A）；接着发现在T24细胞中，GATA3高表达会引起T24细胞的S期和G2/M期加长，G0/G1期缩短，但GATA3表达水平对UMUC3细胞的细胞周期没有影响（图6.B）

图5.验证GATA3转染到T24和UMUC3细胞株

图6.流式细胞术检测GATA3与凋亡和细胞周期的关系

最后，作者利用CCK-8检测与EDU细胞增殖检测分析了GATA3高表达对膀胱癌细胞增殖的影响。CCK-8检测结果显示，在T24和UMUC3两细胞株中GATA3高表达组细胞增殖速度明显小于对照组（图7.A）；EDU检测结果反映了相同的结论，GATA3高表达组出现荧光EDU的细胞数量与对照组相比明显较少（图7.B-C），以上实验说明GATA3高表达会抑制BLCA细胞增殖。

通过上述分析，作者成功将GATA3表达水平与BLCA的细胞增殖和细胞周期表型建立起关联，填补了功能基因和疾病之间的表型空缺。