全球药品 “销量王” 地位，在过去二三十年里不断被挑战，从降糖药、降脂药、再到各类肿瘤靶向药。大多数从业者的关注焦点也从化学制药到生物制药，转到了最前沿的细胞 / 基因疗法。充满创新性的新疗法的出现，正在改变罕见病药物的开发方式。
罕见病并不罕见。根据美国国立卫生研究院的数据，罕见病种类达 7000 多种，其中大部分的罕见病都是遗传病。而在五大类遗传病中，单基因遗传病 (monogenic diseases) 达到 6600 多种。
单基因遗传病是单个基因突变引起的遗传性疾病，无义突变是其主要基因突变类型之一，该突变导致蛋白质翻译提前终止，形成截短型蛋白，进而导致提前终止密码子（Premature termination codons，PTC），约占单基因疾病的 11%。PTC 疾病突变类型简单，发病比例较高，是单基因遗传病治疗的一个重要切入点。
近日，北京大学药学院化学生物学系夏青教授团队发表研究，利用基因密码子扩展技术恢复了杜氏肌营养不良症（DMD）小鼠模型中内源性肌营养不良蛋白 Dystrophin 的全长表达。
图 | DMD 特点（来源：Duchenne.com）
这是全球首次将这项技术应用于 DMD 治疗中。该研究验证了基因密码子扩展技术能够通读内源性无义突变位点，恢复抗肌萎缩蛋白的表达，从而缓解疾病症状，提出了 PTC 疾病治疗和致病蛋白机制研究的新策略。
同时，这项基础研究对于建立基因密码子扩展的 “细胞工厂”、制备多种类型的复制缺陷病毒活疫苗以及拓展 PTC 技术在生物医药中的应用起到了积极的推动作用。
此项研究已于 2016 年申报中国和美国专利，目前处于临床前实验研究阶段。
图 | 该研究发表在 Nature Biomedical Engineering 上
借此机会，生辉联系到了夏青，就该技术及其研究成果进行了交流。夏青于 2004 年获得北京大学医学博士学位，随后跨专业进行了 2 年的无机化学博士后研究。她也曾在南加州大学药学院学习生物技术药物研发、哈佛医学院学习诱导多能干细胞的定向分化机制。
多重交叉学术背景为其科研带来了丰富的视角和判断，她所涉猎的方向包含了临床医学、免疫学、神经科学、无机化学及化学生物学。解读夏青团队的此项研究之前，需要先了解遗传密码子扩展技术。在核苷酸序列翻译成氨基酸的过程中，DNA 首先会转录为 mRNA 并传递到细胞核外，然后转运 RNA（tRNA）会带着相应的氨基酸，通过自身的反密码子与 mRNA 上的密码子互补配对，最终在核糖体中完成蛋白质的生成。所有已知的生命形式都使用 64 个密码子编码的 20 种氨基酸来制造蛋白质。其中包括三个中止密码子不编码任何氨基酸，只代表翻译的终止。但在一些罕见的情况下，某些生物已经进化出编码非天然氨基酸（硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸）的能力，由终止密码子 UGA 和 UAG 编码。2003 年， 美国科学院院士、斯克里普斯研究所化学教授 Peter G. Schultz 团队利用 UAG 密码子在特异性位点引入非天然氨基酸，成功创造了带有 21 个氨基酸的新酵母。目前，已经有上百种非天然氨基酸被成功引入到蛋白的特异位点，所引入的非天然氨基酸的结构和功能也越来越多样化。非天然氨基酸是不由现有的 64 种遗传密码子编码的氨基酸，因其位点特异性强、对蛋白结构扰动小、灵敏度高、使用灵活的特点，在基础研究及药物研发、生物工程等领域都有所应用。那么如何将非天然氨基酸引入蛋白质特异位点？该过程又是否会受到正常终止密码子的影响？要想将非天然氨基酸插入到特定蛋白中，需要带着非天然氨基酸，并能够识别 UAG 密码子的氨酰 tRNA。正常生物体中，氨酰 tRNA 由体内的氨酰 tRNA 合成酶（aaRS，aminoacyl-tRNA synthetase）催化，该酶可以识别特定的氨基酸和 tRNA，然后将两者连接。正交的 aaRS-tRNA 是非天然氨基酸系统发挥功能的关键，其正交性要求 aaRS 不能识别宿主内源的 tRNAs 或者氨基酸，只能氨酰化其配体 tRNA，而 tRNA 和非天然氨基酸也不能被内源 aaRSs 氨酰化。“正常终止密码子和提前终止密码子的翻译终止机制也不一样。” 夏青提醒道。这再一次保证了 aaRS-tRNA 的正交性。基于这一背景，夏青团队在这项研究中选择了吡咯赖氨酸系统 PylRS-tRNAPyl，该系统可以将非天然氨基酸 NAEK 定点插入到蛋白质。在实验中首先将 UAG 编码的这套系统扩展到 UAA 和 UGA，使得这套工具完美匹配单基因病的无义突变三种类型。 “PylRS-tRNAPyl 不会影响体内 20 种天然氨基酸的生化过程。”夏青表示。“这个系统的优势在于，针对所有的密码子提前终止造成的无义突变，都可以用该系统引入非天然氨基酸，达到翻译全长蛋白质的治疗目的，这是一种治疗无义突变罕见病的通用型方式。” 夏青也透露，该系统的美国专利于 2016 年申报，将在本月获批。研究团队在细胞和动物层面均进行了验证，为了评价该方法推向临床治疗应用的可行性和可转化性，团队用 AAV 作为载体构建了 AAV-PylRS-tRNAPyl 系统，以腹腔注射和肌肉注射两种方式，分别评价了其在 DMD 疾病模型小鼠上的全身 / 局部治疗效果。结果表明，两种方式注射 AAV-PylRS-tRNAPyl 均有明显治疗效果，均呈现出 NAEK 依赖性，可以通过停用或调整非天然氨基酸的用量来控制基因治疗的效果，有望实现精准的可控治疗。自 1983 年《孤儿药法案》颁布以来，美国食品和药品监督管理局 (FDA) 批准了 770 多种药物，目前有 800 多个以罕见病为重点的临床开发项目正在进行中。但事实上，只有 5% 的罕见疾病有经过批准的治疗方案。其治疗方式包括小分子药物、蛋白质替代、单抗、小核酸、细胞和基因疗法等。
事实上，基因编辑也是通过校正点突变的方式以达到治疗单基因遗传病的目的。但夏青表示，罕见病人口众多，每个单基因病可能有众多或者上百个突变，每个突变都需要设计 gRNA（向导RNA），无法实现真正的规模生产。在夏青看来，全球对于罕见病领域的投入相对较少，原有的研发思路并不能涵盖所有患者。“我们必须转变罕见病治疗思路，研发通用型疗法。这将对药物申评带来新的挑战。以通读提前终止密码子的通用型治疗方式早有研究，其方式主要包括化学小分子诱导的无义突变通读、外显子跳跃方法，以及抑制性 tRNA 通读。2016 年，小分子通读药物 PTC124 被美国 FDA 拒绝受理，但已经获得欧盟批准，用于治疗无义突变所致的 DMD 患者。针对外显子跳跃方式，目前市场上已经有三种用外显子跳跃法治疗 DMD 的药物。抑制性 tRNA 这条路径，夏青已经研究长达 6 年。“我们用核酸的'语言’，AUCG 重新设计 tRNA，就是为了验证将体内 tRNA 工程化为抑制性 tRNA 是否可行。”“抑制性 tRNA 的效率确实更高，但它需要利用体内的 aaRS 酶，与体内的 tRNA 竞争，而且过表达后，需要更多的药物安全性验证。” 夏青说道。抑制性 tRNA 这条路径，夏青已经研究长达 6 年。“我们用 AUCG 重新设计 tRNA，就是为了验证将体内 tRNA 工程化为抑制性 tRNA 是否可行。”目前已在创办的启夏解码生物公司全面推进研发。根据夏青透露，“公司平台包括三个方向，分别是抑制性 tRNA 系统、密码子扩展系统，以及小分子通读系统，旨在攻克罕见病的无义突变治疗。”她补充道。“mRNA 新冠疫苗的成功，助推了一批产业落地，大家也更有信心攻克疾病。”当今社会的重大特征是学科交叉，交叉创新的最终落脚点也在于复合型人才。作为广泛涉猎多个学科，同时具有多地求学经历的学者，夏青对 “交叉” 这个词有更加深刻的理解，“交叉不等于合作。”她解释说，“合作” 意味着各个专业的研究人员共同完成某个课题，彼此的专业知识仍是相对独立的，并不能实现真正的交融，而 “交叉” 则要求不同领域的知识要叠加在一个人身上，形成复合型人才，只有融会贯通才能碰撞出真正的创新。跨学科加速了新思想、概念和观点的形成，其相互作用产生了独特视角的协同作用。也正是跨学科的背景，让夏青抓住了机遇，成功将非天然氨基酸系统应用于无义突变引起的 DMD 治疗。如今为人师的夏青更是注重学科交叉，“通过跨学科的视角研究，我们的学生可以更深入地了解有关科学发现和技术进步，及其在社会或全球环境中的应用和影响。换句话说，视野越广，对话就越深入，这将导致解决问题的方法更有意义。”“两个不同的学科可能会解决一个单独无法解决的问题，促进和维持一个公正和进步的社会需要对话和跨学科合作。” 夏青说道。
- Shi, N., Yang, Q., Zhang, H. et al. Restoration of dystrophin expression in mice by suppressing a nonsense mutation through the incorporation of unnatural amino acids. Nat Biomed Eng (2021). https://doi.org/10.1038/s41551-021-00774-1
- https://biobuzz.io/why-developing-cures-for-rare-disease-isnt-so-rare-anymore/
- Got $1,000? Invest in These 2 Rare Disease Stocks | The Motley Fool
- https://www.fda.gov/media/108099/download
- https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/wrna.1641
