慢乙肝治疗新指标——血清HBV RNA的前世今生
慢性乙型肝炎（CHB）及其所导致的肝硬化和肝细胞癌（HCC）是严重影响人类健康的重大疾病，据世界卫生组织（WHO）报道，每年有近百万人死于HBV感染相关肝脏疾病[1]。
共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在是导致CHB久治不愈和停药后容易复发的主要原因[2]。目前血清HBV DNA和HBsAg水平是被广泛用于判断CHB患者抗病毒治疗疗效以及巩固治疗后停药的重要生物标志物。
然而实际上，经核苷（酸）类似物（NA）治疗的患者，即便实现了HBV DNA不可测，也依然存在非常高的病毒学反弹和疾病复发率。这说明，现行的生物标志物可能存在一定的局限性。因此，临床上亟需能更好地反映cccDNA存在和转录活性的替代指标。
HBV RNA是一种新型HBV生物标志物。近年来有关HBV RNA的研究越来越受到临床医生们的关注，其价值也逐步得到了大家的认可。今天我们就一起来看看这个新型生物标志物——HBV RNA的前世今生。
HBV RNA与cccDNA
早在1996年，德国科学家 Köck和他的同事在研究HBV能否感染人外周血单核细胞时意外发现，患者血清中还存在HBV RNA[3]。
近年来，国内外学者们相继发现这些HBV RNA实质上可能就是核衣壳内未经逆转录的前基因组RNA（pgRNA）[4,5]。
在HBV感染过程中，转录自cccDNA的3.5 kb pgRNA是病毒逆转录及翻译HBV聚合酶和核心蛋白的模板[6]。在核衣壳内聚合酶通过反转录将pgRNA转化为松弛环状DNA（rcDNA），然后再与病毒蛋白整合成新的完整的HBV释放到细胞外。而血清中的HBV RNA实际上就是未能有效地转换成 rcDNA的pgRNA，并以病毒样颗粒的方式从感染的肝细胞释放进入血液循环。
图1 HBV 感染复制路径（简化）
由于pgRNA是感染肝细胞的cccDNA直接转录生成，所以理论上HBV RNA的水平能够反映cccDNA的水平和转录活性。近些年也有很多研究表明[7-9]，在抗病毒治疗的过程中监测血清HBV RNA水平能够真实反映cccDNA转录活性状态，对辅助临床停药标准的判定以及优化CHB患者的治疗策略有着重要的意义。
2017年9月，上海复旦大学附属华山医院感染科主任张文宏教授团队在Journal of Hepatology上发表了一篇研究[7]，通过结合组织学证据与临床队列证据，发现血清HBV RNA水平确实能反映肝内HBV RNA数量和cccDNA的转录活性，认为HBV RNA可以成为CHB患者功能性治愈的新指标。
研究对47例经恩替卡韦（ETV）治疗至少一年且HBV DNA检测不到(HBV DNA<20IU/ml)的CHB患者的血样分析后发现，竟然有近3/4的患者在血清中检测到HBV RNA (HBV RNA检测下限为200copies/ml)，且所有患者的肝活检样本中都能检测到HBV RNA。为了确定血清HBV RNA水平反映了病毒生命周期的哪个阶段，研究者们利用血清-肝脏配对样本分析了血清HBV RNA水平与肝内HBV复制之间的相关性。
结果发现，血清HBV RNA水平不仅与肝内HBV RNA水平（r=0.725，P＜0.001）密切相关，而且与肝内HBV RNA/cccDNA比值（r=0.584，P=0.001）也显著相关，肝内HBV RNA/cccDNA反映了病毒转录活性。此外，研究还指出血清HBV RNA的积累和低水平的病毒复制可能导致肝病进展，血清HBV RNA水平与坏死性炎症和纤维化组织病理学评分密切相关。
图2 B.血清HBV RNA水平与肝内HBV RNA（左）血清HBsAg（中）的相关性以及变量之间的相关矩阵（右），圆圈大小表示皮尔逊检验的P值，红色表示正相关。C.血清HBV RNA与肝内病毒转录活性(肝内HBV RNA/cccDNA)的相关性。
由此可见，血清HBV RNA水平是反映肝内cccDNA转录活性的可靠替代生物标志物。
除此之外，有不少的研究结果提示，血清HBV RNA水平还可以用于评价CHB患者的抗病毒治疗效果，指导CHB患者安全停药以及复发风险评估。
HBV RNA用于监测NA长期疗效
指导安全停药以及复发风险评估
2019年1月，中国人民解放军总医院第五医学中心徐东平教授团队在Antiviral Therapy上发表了一篇研究[10]，对NA治疗中血清HBV RNA等生物标志物定量检测的临床意义进行了评价。
研究纳入了接受长期NA治疗并定时随访的患者57例，中位治疗时间为5.83年，每个患者取5个时间点采集的样本（共285份血清），定量检测了上述血清HBV指标。
分析结果显示，在抗病毒治疗期间有26例患者达到血清HBV RNA不可测，有6例患者达到了血清HBcrAg不可测，与未实现HBeAg转阴的患者相比，实现HBeAg转阴的患者血清HBV RNA和HBcrAg水平下降更为显著。提示监测血清HBV RNA和HBcrAg水平对NA治疗的患者（尤其是HBV DNA不可测的患者）很有用。
2019年10月，北京大学第一医院的徐小元教授团队对HBV RNA是否可以反映CHB患者接受NA抗病毒治疗的长期预后进行了研究[11]。
研究共纳入了98例接受了7年抗病毒治疗的初治 CHB患者，使用实时定量PCR及特异性引物分析了患者血清中HBV RNA的水平。结果显示，在接受48周抗病毒治疗后，有48.28%已达到HBV DNA不可测的患者血清HBV RNA仍为阳性。
研究者又将入组的患者按照抗病毒治疗48周时血清HBV RNA的状态分为HBV RNA阳性组( n = 63) 和HBV RNA阴性组( n = 35) ，结果发现，在接受抗病毒治疗后，HBV RNA阴性组的患者HBeAg转阴率更高(19/23 vs 19/56, P <0.00)。
这提示在抗病毒治疗过程中即使血清HBV DNA低于检测下限，血清HBV RNA可能仍在不断变化。因此，HBV RNA水平不仅可以作为反映肝内cccDNA活性状态的指标，也可以作为反映CHB患者接受抗病毒治疗长期预后的生物标志物。
既往研究指出，以持续的HBV DNA未检出（低于检测下限）、ALT水平正常和HBeAg血清学转换为前提停药，仍存在很大的病毒学反弹和疾病复发风险[12]。
2019年7月，南方医科大学的侯金林教授团队发表在Clinical Gastroenterology and Hepatology 的一项研究[13]显示，HBV RNA-/DNA-双阴性在指导经治的非肝硬化CHB患者安全停药上具有潜在价值。
研究纳入了130例治疗前HBeAg阳性，接受替比夫定（LdT）±阿德福韦酯(ADV)治疗，且达到停药标准（定义为实现HBeAg血清学转换且HBV DNA<300copies/ml至少48周）的CHB患者，并对这些患者进行长达4年的停药后随访以监控是否发生临床复发(定义为HBV DNA>2000IU/ml且ALT>2ULN)。
结果显示，经过4年停药后随访，有54.7%的患者发生病毒学复发（连续两次HBV DNA >2000IU/ml），30.8%的患者出现临床复发。治疗结束时，HBV DNA及RNA均阴性的患者临床复发风险明显低于HBV DNA和（或）RNA阳性患者（8.0% vs 31.4%, P=0.018）。这一结论在另一个40例接受ETV或富马酸替诺福韦酯(TDF)治疗的HBeAg阳性患者队列中得到验证。该研究提示停药时HBV DNA和RNA检测双阴性的CHB患者可获得较满意的停药后持续应答。
此外，2020年7月，侯金林教授在此人群的基础上还做了另外一项研究[14]，证实了HBV RNA联合HBcrAg能有效预测停药后的临床复发和HBsAg阴转。
研究先是纳入了127例HBeAg阳性接受LdT治疗且达停药标准的CHB患者作为评估队列，再纳入59例接受ETV或TDF治疗的患者作为验证队列。研究结果显示，在治疗结束时，血清HBV RNA和HBcrAg水平是临床复发风险的显著独立预测因子，且停药时达到HBV RNA阴性、HBcrAg＜4log10U/ ml（低风险组）的患者，可实现停药后病毒学持续应答。
图3 评估队列中累计临床复发发生率
低风险组：HBV RNA阴性且HBcrAg<4 log10 U/ml；
中风险组：HBV RNA阳性且HBcrAg<4log10 U/ml，或HBV RNA阴性且HBcrAg>4 log10 U/ml；
高风险组：HBV RNA阳性且HBcrAg>4 log10U/ml
以上两个实验都证明了血清HBV RNA水平在评估CHB患者停药风险方面的价值。
HBV RNA指导干扰素用药以及预测应答
《慢性乙型肝炎临床治愈（功能性治愈）专家共识》[15]指出，干扰素可通过增强pgRNA和核心颗粒的降解，或通过对cccDNA的表观遗传修饰来抑制HBV 转录并减少病毒蛋白如HBsAg的表达。
2019年5月，复旦大学附属华山医院张继明教授团队进行的一项干扰素治疗HBeAg阳性CHB患者临床队列研究就发现，血清HBV RNA水平在预测HBeAg血清学转换上具有潜在价值。
研究发现基线血清HBV RNA水平≤200000copies/ml且经干扰素治疗12周时血清HBV RNA水平≤3000copies/ml的患者，在停药随访24周时HBeAg血清学转换率达到92.9%。提示血清HBV RNA水平可以作为干扰素治疗中HBeAg血清学转换的预测因子[16]。
近年来，随着HBV RNA临床研究的不断深入，临床医生对其临床应用价值也愈发重视和认可。作为cccDNA的直接转录产物，HBV RNA不仅可以反映HBV cccDNA的转录活动状态，有力补充现有“经典指标”HBV DNA和HBsAg的不足，还能指导临床判断预后，是一种非常有价值的新型生物标志物。
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参考文献(上下滑动查看)：
[1]]World Health Organization. Global HepatitisReport.2017.
[2]鲁凤民, 窦晓光, 张文宏, 等. 慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA检测的临床意义[J]. 临床肝胆病杂志, 2018, 34(5): 934-938.
[3]Köck J, Theilmann L, Galle P, et al. Hepatitis B virusnucleic acids associated with human peripheral blood mononuclear cells do notoriginate from replicating virus[J]. Hepatology, 1996, 23(3): 405-413.
[4]WANG J, SHEN T, HUANG X, et al. Serum hepatitis Bvirus RNA is encapsidated pregenome RNA that may be associated with persistenceof viral infection and rebound［J］. J Hepatol, 2016, 65(4): 700-710.
[5]Jansen L, Kootstra N A, van Dort K A, et al. HepatitisB virus pregenomic RNA is present in virions in plasma and is associated with aresponse to pegylated interferon alfa-2a and nucleos (t) ide analogues[J]. TheJournal of Infectious Diseases, 2016, 213(2): 224-232.
[6]Block T M, Guo H, Guo J T. Molecular virology ofhepatitis B virus for clinicians[J]. Clinics in liver disease, 2007, 11(4):685-706.
[7]Wang J, Yu Y, Li G, et al. Relationship between serumHBV-RNA levels and intrahepatic viral as well as histologic activity markers inentecavir-treated patients[J]. Journal of hepatology, 2018, 68(1): 16-24.
[8]BELLONI L, ALLWEISS L, GUERRIERI F, et al. IFN-αinhibits HBV transcription and replication in cell culture and in humanizedmice by targeting the epigenetic regulation of the nuclear cccDNAminichromosome［J］. J ClinInvest, 2012, 122(2): 529-537.
[9]GIERSCH K, ALLWEISS L, VOLZ T, et al. Serum HBV pgRNAas a clinical marker for cccDNA activity［J］. J Hepatol, 2017, 66(2): 460-462.
[10]Liao H, Liu Y, Li X, et al. Monitoring of serum HBVRNA, HBcrAg, HBsAg and anti-HBc levels in patients during long-termnucleoside/nucleotide analogue therapy[J]. Antiviral therapy, 2019, 24(2):105-115.
[11]Luo H, Tan N, Kang Q, et al. Hepatitis B viruspregenomic RNA status can reveal the long‐term prognoses of chronic hepatitis Bpatients treated with nucleos (t) ide analogues[J]. Journal of Viral Hepatitis,2020, 27(3): 323-328.
[12]卞丹丹, 郑素军. 血清HBV RNA定量在指导慢性乙型肝炎抗病毒治疗过程中的作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2020, 36(8): 1838-1841.
[13]Fan R, Zhou B, Xu M, et al. Association betweennegative results from tests for HBV DNA and RNA and durability of responseafter discontinuation of nucles (t) ide analogue therapy[J]. ClinicalGastroenterology and Hepatology, 2020, 18(3): 719-727. e7.
[14]Fan R, Peng J, Xie Q, et al. Combining HBV RNA andhepatitis B core-related antigen: guidance for safely stopping nucleos (t) ideanalogues in HBeAg-positive chronic hepatitis B patients[J]. The Journal ofInfectious Diseases, 2020.
[15]中华医学会感染病学分会，中华医学会肝病学分会. 慢性乙型肝炎临床治愈（功能性治愈）专家共识［J］. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(8): 1693-1701.
[16]Jia W, Zhu M Q, Qi X, et al. Serum hepatitis B virusRNA levels as a predictor of HBeAg seroconversion during treatment withpeginterferon alfa-2a[J]. Virology journal, 2019, 16(1): 61.
*本材料仅针对中国医疗卫生专业人士
*来源：吉智医