慢病毒载体包装二代与三代的区别

慢病毒载体包装

慢病毒载体（Lentivirus vectors）的特性：在非分裂和分裂细胞中稳定整合、转基因的长期表达、低免疫原性，使其成为基因治疗的理想基因转移载体。转基因可以在非分裂或终末分化的非常静止的细胞（例如神经元）中实现。我们的慢病毒载体来源于HIV-1病毒，序列经过精心优化，提高了生物安全性、基因表达水平和病毒转导效率。慢病毒颗粒通常是在包装细胞中共表达病毒体包装元件和载体基因组来产生的。我们开发出了一系列专有技术和试剂，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面提升了慢病毒包装工艺水平。

慢病毒类型

VSV-G假病毒化的第三代慢病毒（默认）
VSV-G假病毒化的第二代慢病毒
使用其他膜蛋白进行假病毒化的慢病毒（如使用冠状病毒刺突蛋白）
无膜蛋白的表面光秃的慢病毒（可用于转导时的阴性对照）

注意：第三代慢病毒包装系统只能包装第三代的慢病毒转移载体。但是第二代慢病毒包装系统既能包装第二代，也能包装第三代的慢病毒转移载体。第三代慢病毒转移载体上的5’ LTR中的U3元件是被一个外源启动子替代（如CMV启动子或者RSV启动子），使其不依赖Tat蛋白进行HIV RNA基因组的转录，故第三代慢病毒包装系统的包装质粒不含Tat蛋白。第二代慢病毒转移载体上的5’ LTR是野生型的LTR，含有U3、R和U5元件，依赖Tat蛋白转录HIV RNA基因组，故第二代慢病毒包装系统的包装质粒含有Tat蛋白。

第二代 VS 第三代慢病毒载体系统？

慢病毒载体系统经历了至少三代演变发展，随着代次更新，生物安全性逐步提高。第一代系统（1st generation）虽然使用了三质粒系统，但是仍保留了大部分HIV基因组，安全性欠佳，现已基本淘汰。相比第一代系统，第二代系统（2nd generation）剔除了与病毒复制相关的Vif、Vpr、Nef等辅助基因，仅保留了与病毒转录、组装相关的Gag、Pol、Tat和Rev基因。值得注意的是，第二代系统的转移载体是使用野生型 5' LTR启动子转录HIV RNA转录本的。野生型 5' LTR启动子依赖Tat蛋白的结合才能激活其转录活性，所以第二代慢病毒的包装必须使用第二代系统的包装质粒，因为它能表达Tat蛋白。

第三代系统在第二代基础上做了这些改进：

1. 包装质粒被拆分成两个，分别表达Rev和Gal/Pol，进一步降低了包装质粒和转移载体在包装过程中产生DNA重组的几率，从而降低形成复制型病毒的风险；

2. 包装质粒上Tat基因被去除，进一步降低致癌的风险（Nunnari G 2008)。而转移载体上的野生型5’ LTR元件改造成Hybrid 5' LTR，删除了U3区域，并融合了强启动子，如CMV或者RSV启动子，可以不依赖Tat转录HIV RNA；

3. 3’LTR的U3区域被删除，不能将完整的3' LTR复制到5' LTR上，原病毒DNA就不能自我转录生成新的病毒RNA，具有这个特征的病毒被称为自我失活型（Self inactivation，简称SIN）。第三代系统需要转染四个质粒（1个转移载体、2个包装质粒、1个包膜蛋白表达质粒），对生产技术要求更高一些。第二代慢病毒包装质粒可以包装第二、第三代的转移载体，而第三代慢病毒包装质粒系统缺少Tat，不能包装第二代转移载体。