Bai Lab早报：孕酮（PR）受体如何调节雌激素（ERa）受体？
Progesterone receptor modulates ERα action in breast cancer.
发表状况：doi:10.1038/nature14583
研究团队：
Hisham Mohammed，Wayne D. Tilley & Jason S. Carroll
英国剑桥大学癌症研究所
摘要：
孕酮受体（PR）的表达通常被当做雌激素受体α（ERα）功能和乳腺癌预后的生物标志物。在这里，我们显示PR不仅仅是ERa诱导的基因靶标，也是调节其行为的ERα相关蛋白。在激动剂配体存在的情况下，PR联合ERα以指导乳腺癌细胞内的ERα染色质结合事件，产生独特的与临床预后良好相关的基因表达程序。孕酮可以抑制雌激素介导的ERa 细胞系异种移植物和原代ERa 乳腺肿瘤外植体的生长，并且当与ERα拮抗剂偶联时抗增殖能力增加。PGR（编码PR的基因）的拷贝数丢失是ERa 乳腺癌中的共同特征，其解释了为何一部分病例中PR水平比较低。我们的研究结果表明，PR作为分子变阻器控制ERα染色质结合和转录活性，这对乳腺癌的预后和治疗干预具有重要意义。
背景：
有令人信服的证据表明，PR作为激素替代治疗的一部分，会增加乳腺癌的风险，这意味着PR信号可能导致肿瘤的形成。然而，与包含孕酮替代治疗相关的乳腺癌风险增加主要是因为特殊的合成孕激素，特别是醋酸甲羟孕酮（MPA）（已知也具有雄激素性质）。而使用天然孕酮的相对危险性不显著。在ERa 乳腺癌中，PR通常被作为疾病的阳性预后指标，但PR信号的作用机制尚不清楚。虽然激活PR可能促进某些妇女和某些模型系统中的乳腺癌，但孕酮治疗已显示在ERa PR 乳腺癌细胞系中是抗增殖的，并且PR也被证明可以抵抗雌激素刺激的ERa PR 患者衍生的异种移植物的生长。另外，阻断ERa 乳腺癌细胞中外源性PR的表达可以阻断雌激素介导的增殖和ERα转录活性。此外，在ERa 乳腺癌患者中，PR是对他莫昔芬辅助治疗反应的独立预测因子，高PR水平与早期疾病转移事件减少相关，手术前应用黄体酮注射液可提高临床获益。这些观察意味着在雌激素驱动的ERa 乳腺癌背景下的PR激活可具有抗肿瘤发生作用。为了支持这一点，PR激动剂可以在使用ERα拮抗剂复发的ERa 乳腺癌患者中发挥临床益处。
一般通过评估ERa，PR和HER2的表达来确定乳腺癌组织学亚型并指导治疗选择。PR是ERα诱导的基因，而ERa PR HER2-肿瘤临床效果更好，因为PR阳性被认为由激活的ERα复合物驱动，因此可能对内分泌药物如他莫昔芬或芳香酶抑制剂有反应。虽然ERa PR 肿瘤比ERa PR-肿瘤临床预后更好，但即使在ERα和PR状态相似的肿瘤中，对ERα拮抗剂的临床预后也可能有所不同，最近的证据表明PR可能是预后指标，而不是预测指标。一些对一类ERα拮抗剂具有抗性的ERa PR-肿瘤从另一类获得临床益处，这表明在一部分ERa PR-乳腺癌中，缺乏PR表达不代表ERα复合体没有功能。有人提出，无功能的ERa复合理论不能完全解释PR阴性。另一种假设是其他因素导致PR表达的丧失，并因此影响乳腺肿瘤对ERα靶向疗法的反应。
实验方法：
1． 培养ERa PR MCF-7 和T-47D细胞，采用氨基酸同位素标记培养细胞，培养基中有足够的雌激素使ERa最大程度结合染色质。雌激素刺激MCF-7产生可以检测到PR，而T47D不诱导PR的产生。随后用天然孕酮或合成孕酮R5020处理两种细胞。然后交联细胞，内源性PR采用快速染色质免疫沉淀法进行质谱分析（chip-MS）。
2． 由于PR是一种转录因子，我们推测孕酮诱导的PR和ERa之间的相互作用改变了ERα-辅因子复合物的染色质结合性质。用孕酮，R5020或媒介物对照刺激MCF-7和T-47D细胞3或24小时，随后做chip-seq（染色质免疫沉淀后测序），分析ERa和PR以及共活化剂p300的全基因组。
3． 为了鉴定孕酮诱导的ERa结合事件的转录靶点，我们用孕酮，R5020或媒介物处理雌激素刺激的MCF-7和T-47D细胞3小时，并进行RNA-seq。
4． 为了探讨孕酮刺激对体内ERα1肿瘤生长具有有益作用的假说，我们在NOD / SCID / IL2Rg2 / 2（NSG）小鼠体内建立了MCF-7-萤光素酶异种移植物，并暴露小鼠（即无激素）释放雌激素丸或缓释雌激素加标准高浓度孕酮丸。每种条件下植入10个肿瘤（每只小鼠两个肿瘤，每个条件5只小鼠），并使用生物发光成像监测肿瘤形成。
5． 我们在卵巢切除小鼠中重复了MCF-7异种移植实验，以消除与内源性小鼠激素有关的任何混淆问题。
6． 为了将我们的发现扩展到原发性肿瘤，我们采用了一种体内原代肿瘤培养系统来短时间培养ERa PR 原发性肿瘤，以研究激素治疗对细胞生长的影响。
7． 鉴于在MCF-7细胞系中观察到的PGR拷贝数丢失，我们通过评估2,000个乳腺癌的METABRIC队列中的基因组数目改变（CNA），探究这是否是在乳腺癌患者中观察到的常见现象。
实验结果：
1. 图1 | PR是孕酮处理后的新的ERα相互作用蛋白。 a，b，MCF-7和T-47D乳腺癌细胞进行SILAC标记，用激素处理分别得到PR（a）或ERa（b）的chip-ms数据。绘制两个细胞系中鉴定的差异蛋白质，所有蛋白质都在补充表1中提供。c，PR与ERα的相互作用的免疫共沉淀（co-IP）验证. d，模型显示PR和ERα（ER）-辅因子复合物之间相互作用的可能机制。
2. 图2 |孕酮将雌激素刺激的ERα结合事件重定向到新的染色质基因座和转录靶标。 ERa，PR和辅激活物p300在富含雌激素的培养基中生长并用孕酮或R5020处理的T-47D细胞中的的ChIP-seq结果。 a，孕酮 / R5020诱导ERα，PR和p300结合事件的实例结合区。 b，孕酮处理3小时后来自T-47D细胞的ERa，PR和p300 ChIP-seq数据的热图。 c，孕酮诱导的ERα，PR和p300结合位点之间的重叠，仅代表孕酮诱导的ERα结合事件。 n三个独立的生物复制品。 d，在雌激素条件下（对照）孕酮或R5020处理3h后进行RNA-seq。 n 8个独立的生物学重复。进行GSEA分析，比较孕酮诱导的转录物与T-47D细胞内孕酮诱导的ERα结合事件。
3. 图3 |孕酮治疗抑制ERa 肿瘤进展。
a，将MCF-7-萤光素酶细胞植入NSG小鼠中，对照雌激素（E2）小丸或雌激素加孕酮（E2 Prog）小丸（n=10）。 b，通过生物发光评估肿瘤形成的图示。 c，去卵巢NSG小鼠在用雌激素或雌激素加黄体酮处理以后，随机选择异种移植肿瘤（n=6）进行ERa ChIP-seq。 d，用单独的雌激素（E2）或孕酮（R5020）或两者联合培养的原代乳腺癌组织的增殖反应（Ki67染色）。e ，在离体培养的乳房肿瘤组织切片Ki67染色的代表性图像来自两名患者。 f，MCF-7异种移植物在雌激素小丸存在下能够在NSG小鼠中生长。图示为用空载，他莫昔芬，孕酮或他莫昔芬加孕酮处理小鼠标准化的肿瘤体积。
4. 图4 | 在ERa 乳腺癌中PGR基因组位点拷贝数量丢失。 a，评估PGR基因组基因座中的METBRIC乳腺癌（共1937个）的拷贝数变化。 b，所有ERa 病例中PR mRNA水平和拷贝数状态之间的相关性。c，Kaplan-Meie曲线生存分析显示在所有ERa 病例中乳腺癌特异性存活。d，METABRIC病例中腔内B肿瘤ERαmRNA水平的变化.e，评估ERa METABRIC肿瘤中在雌激素培养条件下的细胞系进行严格的孕酮诱导或抑制基因的表达水平。
结论：
我们的数据显示，PR和ERa在乳腺癌细胞中功能性连接的复杂性比以前认识到的要高。在预后良好的鲁米那A ERa PR 乳腺肿瘤中，当暴露于雌激素和孕酮，都有一个ERa染色质结合事件是由PR结合事件决定的。PGR基因组位点的改变似乎是减少PR表达的相对常见的机制，这可能因此导致改变的ERα染色质结合和靶基因表达模式，而增加乳腺致瘤性并预后不良。这种ERa-PR串扰可能受许多变量的直接影响，包括相对受体水平和激素环境。雌激素的存在或不存在可能显着改变PR-ERα相互作用的结果，因此PR激活的抗增殖作用可能仅限于雌激素状态。我们的研究结果显示，PR不仅仅是功能性ERa复合物的标志。相反，我们建议由于PR和ERa之间的串扰，PR是ERα功能的关键决定因素。在雌激素的情况下，激活的PR作为ERa 乳腺肿瘤的增殖性阻碍，通过重新引导ERα染色质结合并改变靶基因的表达，以便作为将增殖状态转变成分化更强状态的的开关。
Abstract
Progesteronereceptor (PR) expression is used as a biomarker of oestrogen receptor-a (ERa)function and breast cancer prognosis. Here we show that PR is not merely anERa-induced gene target, but is also an ERa-associated protein that modulates itsbehaviour. In the presence of agonist ligands, PR associates with ERa to directERa chromatin binding events within breast cancer cells, resulting in a uniquegene expression programme that is associated with good
clinicaloutcome. Progesterone inhibited oestrogen-mediated growth of ERa cell linexenografts and primary ERa breast tumourexplants, and had increased anti-proliferative effects when coupled with an ERaantagonist. Copy number loss of PGR, the gene coding for PR, is a commonfeature in ERa breastcancers, explaining lower PR levels in a subset of cases. Our findings indicatethat PR functions as a molecular rheostat to control ERa chromatin binding andtranscriptional activity, which has important implications for prognosis andtherapeutic interventions.