文献解读 | TDRD 5与pRNA前体结合，选择性增强小鼠粗线piRNA的加工
论文：TDRD5 binds piRNA precursors and selectively enhances pachytene piRNA processing in mice（TDRD 5与pRNA前体结合，选择性增强小鼠粗线piRNA的加工）
摘要
粗线RNA是哺乳动物睾丸中最丰富的pRNAs。它们是由原始的piRNA生物合成途径的长前体转录本产生的，但参与粗线piRNA前体加工的因素尚不清楚。
在此，我们证明了Tudor结构域5(TDRD 5)蛋白在小鼠粗线体piRNA的发生中起着重要的作用。TDRD 5在小鼠生后生殖细胞中的条件灭活表明，TDRD 5选择性地调节了大量产生pRNA前体的粗线体pRNA的产生，而对低含量的piRNA几乎没有影响。
出人意料的是，前体的5‘端加工不需要TDRD 5，但对于促进转录本其他区域的pRNAs生产至关重要。此外，我们还发现TDRD 5是一种与pRNA前体直接相关的RNA结合蛋白。
这些观察建立了TDRD 5作为一种pRNA生物发生因子，并揭示了在粗线体piRNA加工开始时两个可分离的基因步骤。
TDRD 5在生后生殖细胞损害精子发生中的丢失
TDRD 5在胚胎和减数分裂雄性生殖细胞中的表达34,35。TDRD 5缺失突变在这两个阶段都影响了pRNA的产生和精子发生，因此TDRD 5对piRNA生物发生有明显影响的结论是复杂的。
为了测试TDRD 5在粗线体piRNA生物发生中的直接作用，我们生成了Tdrd 5条件敲除小鼠Tdrd 5出生后第3天雄性生殖细胞被斯特劳8-CRE。
我们用Tdrd 5敲除-第一等位基因(Tdrd 5Tm1a)和老鼠Tdrd 5条件等位基因(Tdrd 5fl)通过FLP重组。
在Tdrd 5fl等位基因，第7外显子Tdrd 5由两个氧氟沙星位点组成，结合斯特劳8-CRE，我们获得了斯特劳8-CRE+, Tdrd 5Fl/−有条件的敲除小鼠(参见Tdrd 5CKO)，其中TDRD 5在所有成年男性生殖细胞系中被删除。
TDRD 5成功灭活Tdrd 5CKO小鼠经原位杂交和westernblotting证实，在成体中既没有tdr 5 mRNA，也没有tdd 5蛋白。Tdrd 5CKO睾丸. Tdrd 5CKO雄性小鼠睾丸萎缩，平均占野生型对照睾丸重量的50%。
并由于生殖细胞在圆形精子细胞期的停滞而不育。未形成伸长的精子细胞或精子。因此，只有圆形的精子细胞可以观察到。在……里面Tdrd 5CKO在第5步前，睾丸、圆形精子细胞作为顶体颗粒被阻滞，但在停止的精子细胞中没有顶体帽。
其后被捕Tdrd 5CKO圆形精子细胞在达到生精上皮第VIII期后表现出明显的DNA损伤。这些结果表明，出生后TDRD 5的表达是精子发生所必需的。
TDRD 5是粗线体pRNA生物发生所必需的
我们接下来研究了生后生殖细胞特异性TDRD 5缺失对pRNA生物发生的影响。成年野生型和野生型总RNA的放射标记Tdrd 5CKO睾丸显示总pRNA产量严重下降。
然而，在Tdrd 5CKO睾丸呈正态分布。野生型和野生型小RNA序列分析Tdrd 5CKO总RNA显示，两个占主导地位的群体构成了剩余的pRNAs。
Tdrd 5CKO睾丸，对应于25~28 nt Mili结合的piRNAs(Mili-piRNAs)和29-32 nt MIWI结合的piRNAs(MIWI-piRNAs)。对野生型和野生型总RNA的相对丰度进行定量分析。Tdrd 5CKO睾丸，我们使用总微RNA(MiRNAs)，一个广泛使用的参考小RNA群体。
使每个文库中的pRNAs标准化。在对miRNA读取的总数进行正常化之后，Tdrd 5CKOPRNA群体为野生型水平的25-30%。25-28 nt pRNAs的表达未受影响，而29-32 nt的piRNAs在Tdrd 5CKO。
当我们检查与Mili或MIWI结合的无线电标记的piRNAs时，证实了这一模式。MILI的表达和定位未受影响Tdrd 5CKO睾丸(附图)3A和C)。MIWI表达降低，定位模式基本不受影响。
PRNA缺乏症的临床研究Tdrd 5CKO睾丸与米维击倒米维高)小鼠，表现出正常的mii-piRNAs，但没有miWI-piRNAs。PIRNA缺陷Tdrd 5CKO小鼠与粗线体pRNA生物发生因子的作用不同MOV10L1CKO小鼠，产生mii-piRNAs和miWI-piRNAs的完全丢失。
免疫共沉淀mii-piRNAs和miWI-piRNAs的RNA-seqTdrd 5CKO睾丸显示了5‘U-偏见，一个在野生型睾丸中观察到的pRNA 5’末端特征。这表明Tdrd 5CKOPRNA 5‘形成正常。
尺寸分布Tdrd 5CKOMII-piRNAs和MIWI-piRNAs与野生型相似，提示TDRD 5缺乏症对pIRNA的微调没有显著影响(补充图5)。这些数据共同确定了TDRD 5在粗线体piRNA生物发生中的重要作用。
Tdr 5缺陷选择性地减少了簇源性piRNAs
TDRD 5选择性地控制了pRNA簇源粗线型piRNAs的产生.
a从成体WT中提取的总pRNA的基因组注释，Tdrd 5CKO，和米维高睾丸。PiRNA簇：由Li等人定义的214个piRNA簇。19.
b成虫总RNA的相对丰度，Tdrd 5CKO，和米维高由miRNA归一化的睾丸。注意：piRNA簇衍生的piRNAs在Tdrd 5CKO睾丸。
c来自成年WT的Mili结合pRNAs的基因组注释，Tdrd 5CKO，和米维高睾丸。
d成年WT和Wt的miWI结合pRNA的基因组注释Tdrd 5CKO睾丸。
e从WT和Wt分离的粗线精母细胞(PS)中提取总pRNA的基因组注释Tdrd 5CKO睾丸。
f从WT和Wt分离的粗线精母细胞中提取的总pRNA相对丰度Tdrd 5CKO用miRNA归一化睾丸。
讨论
在本研究中发现的一个重要的方面是，在一个依赖于TDRD 5的pIRNA簇中，pRNAs在pRNA簇5‘端的映射明显正常，并且pRNAs映射到簇的其他区域的产生减少。
这表明粗线RNA前体加工是遗传分离的。在Mili-piRNAs和MIWI-piRNAs中观察到了单个簇内前体处理的解偶联.不知道前体5‘端的处理为什么不需要TDRD 5，但清楚的是，在没有TDRD 5的情况下，PPC仍在继续招募pPC的pRNA前体。
我们的TDRD 5剪辑-seq结果表明，TDRD 5直接与ppc关键酶MOV10L1和MitoPLD结合，使ppc关键酶MOV10L1和MitoPLD对ppc关键酶MOV10L1和MitoPLD的前体没有优先识别。
可以想象，TDRD 5的丢失会破坏前体在PPC上的不稳定性，从而导致RNA的丢失和前体5‘处理后的最终降解。
虽然我们不能排除TDRD 5的丢失也可能影响切割酶MitoPLD的加工性，但TDRD 5与piRNA前体的直接联系以及在TDRD 5失活上不存在piRNA前体积累的现象与TDRD 5在前体保留/稳定中的直接作用是一致的。
因此，我们建议将TDRD 5作为PPC的核心成分，在pRNA生物发生过程中发挥下游pRNA前体招募的作用，以稳定和增强前体处理。
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