基于双抗作用机制的生物测定方法
细胞桥接
细胞桥接双特异性抗体（Bispecific antibodies，BsAbs）结合两个不同细胞的表面抗原，一个在效应细胞表面，另一个在靶细胞/肿瘤细胞表面，导致下游信号网络的激活和靶细胞的杀伤。
目前依旧最热的研究管线是T细胞依赖性BsAbs（T-cell dependent BsAb，TDBs），包括一个CD3抗体臂和一个靶细胞表面的肿瘤特异性抗原抗体臂。也有一些BSAbs通过结合其他表位，如CD5或CD28等共刺激受体来激活T细胞。BsAbs对靶细胞和T细胞的连接导致免疫突触的形成，诱导T细胞激活，并导致穿孔裂解靶细胞的酶和颗粒的释放。
TDBs作用机制（Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5350）
TDBs利用患者自身的免疫系统，无需MHC-复合物的激活，不依赖于TCR表位特异性来杀伤肿瘤细胞。虽然TDBs通常比标准的单克隆抗体药物更复杂、生产和表征更困难，但它们目前比CAR-T治疗更便宜，后者必须为每个患者单独生产。此外，与CAR-T疗法相比，TDBs可以具有更有利的安全性，其不良事件越少，如全身细胞因子释放综合征（这是与免疫疗法相关的最常见不良事件）。
除了TDBs之外，还有一些双特异性抗体，通过同时结合CD16(FcγaRIII)和肿瘤特异性抗原来招募和激活NK细胞；通过靶向CD89来招募和激活巨噬细胞。。
生物测定方法
1.结合实验：任何基于抗体技术的药物，结合实验都是基础。通常使用ELISA法和SPR法。检测双特异性抗体和相应抗原的结合能力。
2.生物活性测定：桥接法双特异性抗体，其主要活力是效应细胞和靶细胞形成免疫突触，进而活化，杀伤靶细胞。因而报告基因法检测效应细胞激活，以及细胞杀伤实验检测靶细胞的杀伤效果，是主要生物活性测定实验。
3.其他功能测定：通过流式细胞术检测细胞清除，细胞因子释放，或者细胞表面marker变化
4.效应功能：主要检测ADCC和ADCP。
配体-受体阻断或激活
这类双特异性抗体，具有靶向多个受体的能力，在特定的细胞环境下靶向和激活一个受体，尤其是单独一个抗体无法特异性激活的受体。如抗成纤维细胞生长因子受体(aFGFRI)/抗Klotho(aKLB)BsAb激活FGFRI/KLB受体复合体，导致体重减轻和减少临床前模型中与肥胖相关的疾病。
FGFR1受体（J. Clin. Invest. 115, 1627–1635）
通过选择性地靶向FGFRI/KLB，该分子在与KLB结合时激活FGFRI，从而避免广泛的FGFRI激活（FGFRI受体在组织中广泛的表达），减少单克隆抗体FGFRI激动剂相关的副作用。
除了作为受体激动剂外，BsAbs还可以是有效的受体拮抗剂。对于HER-2（曲妥珠单抗）治疗耐药的患者，HER2双抗是一个好的选择。HER2XCD3双抗可以通过桥接T细胞进行细胞杀伤，HER2XHER3双抗则阻止配体激活HER3，并抑制HER2高表达肿瘤中的PI3K信号，从而克服肿瘤对于HER2单抗的耐药。
HER2单抗和双抗作用机制（Exp. Hematol. Oncol. 2017, 6, 31.）
BsAb有时与mAb的联合治疗的目的相同，但在某些情况下，BsAb提供了一种特殊的优势。经典的案例是PD-1XCTLA4双抗（如下图MEDI5752），通过优先抑制PD1+细胞上的CTLA-4，导致与免疫激活相关的不良事件比传统联合治疗更少。单价CTLA-4抗体臂对CTLA-4的抑制降低，但是不影响PD-1抗体臂对于PD-1的抑制。因此，BsAb能够在PD1+细胞上饱和CTLA-4受体，而不广泛抑制CTLA-4，从而导致更少的不良事件。使用该BsAb对CTLA-4和PD1的双特异性靶向也会导致PD1的内化和降解，这是通过CTLA-4和PD1mAbs的组合没有观察到的效果。
MEDI5752作用机制（Cancer Discov. 2021.）
生物测定方法
1.结合实验：使用ELISA和SPR法进行单靶点和双靶点的结合实验，检测双特异性抗体和抗原的结合能力等。
2.生物活性：受体激活或阻断后的细胞活性变化，如增殖，凋亡，细胞因子释放等。
3.其他功能研究：如激活或阻断受体后，下游激酶活性改变，钙流变化等
4.效应功能：CDC、ADCC、ADCP、FcγR结合等
辅助因子模拟
Emicizumab (marketed name Hemlibra®)，是一种用于治疗A型血友病的BsAb。BsAb与凝血因子X和IX结合，因此能够发挥凝血因子XIII的作用（在许多血友病A患者中缺少的凝血因子）。
Emicizumab 作用机制（Thromb. Haemost. 2017, 117, 1348–1357）
生物测定方法
1.结合实验：使用ELISA和SPR法进行单靶点和双靶点的结合实验
2.生物活性：FXa活性
3.其他功能研究：凝血酶生成分析
归巢双抗
归巢BsAbs的一个抗体臂负责将分子带到很难抵达的位置。比如一些BsAbs已经被开发出来，能够通过靶向转移酶受体（transferase receptor，TFR）来跨越血脑屏障，一旦穿过屏障，非转移酶受体臂就可以靶向感兴趣的治疗靶点（比如淀粉样蛋白和其他阿尔茨海默病靶点 BACE1）。
TfR-BACE1双抗结构示意图（Sci. Transl. Med. 2014, 6, 261ra154.）
此外，还有串联scFv 的BsAb的例子，它针对激活的血小板和SCA-1，帮助将干细胞带到损伤的位置；它正在探索用于治疗心肌梗死。
生物测定方法
1.结合实验：BLI及竞争法ELISA。
2生物活性：归巢抗体之外分子的生物活性。
3.其他功能研究：荧光示踪检测双特异性抗体在体内和细胞内分布等 。
小编总结
双抗或者多特异性抗体的多重作用机制，是克服肿瘤耐药，丰富肿瘤治疗策略重要途径。但双抗的多重作用如何测定，才能充分验证其作用机制及表征有效性，也是双抗开发的难点。
参考文献