研制了细胞用电动纳米注射器“电渗流纳米泵” ——面向细胞治疗的新型细胞内物质导入设备——

研制了细胞用电动纳米注射器“电渗流纳米泵” ——面向细胞治疗的新型细胞内物质导入设备——

发表的要点 开发了由导电性高分子和金属构成的复合纳米管片 发现向该薄片通电可以促进物质输送3倍以上的电渗流泵现象 蛋白质( GFP )可以以导入效率84%、细胞存活率98.5%导入细胞内，有望作为有助于再生医疗和细胞治疗的医疗器械被活用

早稻田大学研究生院信息生产系统研究科的三宅丈雄教授等的研究小组、理化学研究所生命机能科学研究中心的木川隆则小组组长和美川务专职研究员等的研究小组，开发了被导电性高分子包复的金属纳米管片，发现通过通电会产生电渗流※1，促进通过细胞膜的物质的输送速度。 并且确认了通过利用这种电渗流现象，可以安全且有效地将物质导入细胞内。 本导入技术将纳米管物理插入细胞使用，因此无需选择导入物质的大小、形状、电荷。 因此，通过将各种功能性物质导入细胞内，有望制造出新的细胞物种，并应用于再生医疗和细胞治疗。该研究由科学研究费补助金、科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业先驱“电子离子控制型生物电子学”( JPMJPR20B8 )以及研究成果展开事业SCORE大学推进型“高效细胞内物质导入印章和显微镜搭载系统的事业化验证”( JPMJPR20B8 )组成。论文名称:高性能和可控制交通运输电气化学金属有机化合物

细胞用电动纳米注射器“复合纳米管电渗流泵” (1)迄今为止的研究中明白的事情

细胞治疗是在体外加工、培养、评价细胞后，通过向人类等移植功能性细胞治疗疾病的新医疗。 其市场逐年大幅扩大，随之创造出各种各样的新产业。 一般的再生细胞治疗工序分为采集、输送自身细胞的工序①、加工、设计送达的细胞的工序②、培养、增殖设计的细胞的工序③，最后是评价安全性和功能的工序④(图1 )。 目前，在各工序中，新元素技术和新产品的开发正在进行。

图1 .细胞治疗方面的市场和相关产业

在这样的背景下，我们的研究小组以工程②中的细胞加工设计相关的技术开发为中心进行了研究。 工序的主要目的是向细胞内导入外源性物质，通过改变细胞内功能(编程)来设计功能性细胞。 但是，细胞膜本来就会选择物质的出入，所以很难把物质送到细胞内。 作为迄今为止的方法，使用了化学/生物方法(病毒载体法)和物理方法(电穿孔法)。 关于利用病毒将遗传物质输送到细胞的病毒载体法，载体的调整等需要时间和精力，另外，向细胞膜的摄取经由细胞从外界摄取物质的作用——内吞※2，因此需要时间，并且能够导入的物质和导入 在另一方面的物理方法中，经常利用通过通电在细胞中短期开孔，通过其产生的微小孔将物质传递到细胞内的电穿孔法。 虽然可以将具有较大分子尺寸和不同电荷的物质导入细胞内，但由于施加的电压需要几伏以上，因此存在死亡细胞数量多，以及意外的电信号向细胞传递的课题。 为了解决这样的课题，关于通过将空管的微/纳米针插入细胞来将目标物质导入细胞内的纳米注射器的研究很盛行，但是由于不断开发的纳米注射器是单针的，而且需要在微型细胞中插入单针的机械手，因此主要需要逐个细胞进行导入。因此，我们的研究小组开发了排列有纳米管的薄膜(片)，通过将本纳米管插入细胞，开发了短时间内高效地将物质传递到细胞的纳米注射器(图2 )。 迄今为止，成功地将从低分子到高分子导入了细胞内，这次，通过将新的材料(导电性高分子)包复在金属制纳米管上，细胞存活率得到了飞跃性的改善，进而发现了以膜电位以下的微小电压高效地将物质送到细胞内的新原理(电渗流泵)，下面在(2)之后详细说明。 特别是，可以期待作为高效传递至今为止难以传递到细胞内的蛋白质和抗体等高分子的技术(表1 )。

图2 .现有方法的课题和新提案技术的概要及其特征

表1 .现有物质导入技术和本方法的特点

(2)通过这次的研究已经明确了要重新实现的事情 三宅研究小组此前开发了金属制纳米管，向细胞内导入物质的技术，这次，通过在金属制纳米管上包复导电性高分子，成功用电控制了离子的流动。 在以往的金属纳米管中，向膜施加正负电压后，可以测量正负离子电流。 这意味着离子可以双向通过纳米管膜。 另一方面，复合纳米管中，仅在施加正电压时离子流动的整流特性(离子二极管)得到了确认。 该二极管特性在施加电压仅为±100mV的范围内产生(图3 )。 我们发现，这是因为复合纳米管的出入口(上面和下面)是由不对称的纳米结构体构成的，而且其表面带电。 另外，为了将复合纳米管插入细胞，建立了如图4所示的印记系统，并使用HeLa细胞※3确认了存活率。 如果将传统的金属纳米管插入细胞，5分钟内将减少到约93%的存活率，30分钟后仅为1%。 另一方面，使用此次开发的复合纳米管时，即使持续插入30分钟，生存率也维持在约95%的高值。 我认为主要原因是抑制了从细胞流入纳米管的物质的扩散。

图3 .复合纳米管中的离子电流（整流特性）

图4 .纳米管的细胞内插入和存活率 最后，使用开发的复合纳米管，将卡塞尔低分子和GFP蛋白质导入HeLa细胞，将DNA质粒导入NIH3T3细胞※4，得到了结果(图5 )。 结果均表明，外加±50mV的电后，将促进物质的导入效率。 在可卡因低分子方面，实现了导入效率99%、细胞存活率96.8%，在GFP蛋白质方面，实现了导入效率84%、细胞存活率98.5%。 关于DNA质粒，实现了约10%的转染率※5。

5 .高分子等的细胞内导入

(3)研究的波及效果和社会影响 这次，我们的研究小组开发了与细胞相容性高的新纳米材料(复合纳米管)，实现了物质通过这个纳米管传递到细胞的物质导入法。 我们认为，这可以将通过现有技术难以导入或无法导入的物质(正电荷、高分子、微粒、小器官等)传递到细胞，进而可以提供可以任意加工设计细胞治疗所需的细胞种类的工具。 (4)今后的课题 我们希望改良本技术，以便在再生医疗和细胞治疗的现场使用。 特别是对医疗现场使用的细胞，导入新物质，开发新的制药(细胞注入液)是值得期待的。 (5)研究者的评论 今后，希望将各种功能性高分子导入细胞内，致力于细胞的功能控制和新的细胞种类的开发。 另外，除了粘着性细胞外，对开发向浮游性细胞导入物质的技术也很感兴趣，期待对本项目感兴趣的企业和研究机构的咨询。 (6)用语解说 ※1电渗流:通过施加电压诱发液体流动的现象。 是在液体和固体相接的界面发生的现象，特别容易在纳米尺度的微小结构体中发生。 ※2内吞:物质进入细胞内的现象。 物质和细胞膜发生相互作用，通过膜的形态变化被吸收。 ※3 HeLa细胞:来自人类的癌细胞。 作为一般的培养细胞，在基础研究中得到了广泛的应用。 ※4 NIH3T3细胞:来源于小鼠胎儿的皮肤细胞。 作为一般的培养细胞，在基础研究中得到了广泛的应用。 ※5转染率:将核酸导入细胞内，使目标物质表达的比例。(7)研究资助 科学研究费补助金基础研究b 科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业的先驱“电子离子控制型生物电子学”( JPMJPR20B8 ) 科学技术振兴机构( JST )研究成果展开事业SCORE大学推进型“高效的细胞内物质导入印章和显微镜搭载系统的事业化验证”( JPMJST2053 )

(8)论文信息 杂志名称:小型科学 论文名称:高性能和可控制交通运输电气化学金属有机化合物 作者姓名(所属机构名称) :鲍文章(1) #、迪诺正片(1)、石义明(1)、卡兹哈IRO Oyama (1)、Masahiro Ito(2)、Masa OMikarro 所属机构名称: 1 :早稻田大学理工学术院 2 :理化学研究所 3:JST先驱 # #笔头作者、*责任作者 刊登日期(中欧时间):2021年9月9日(周四) DOI:10.1002/smsc.202100069 )事业化验证”( JPMJST2053 )

(3)研究的波及效果和社会影响 这次，我们的研究小组开发了与细胞相容性高的新纳米材料(复合纳米管)，实现了物质通过这个纳米管传递到细胞的物质导入法。 我们认为，这可以将通过现有技术难以导入或无法导入的物质(正电荷、高分子、微粒、小器官等)传递到细胞，进而可以提供可以任意加工设计细胞治疗所需的细胞种类的工具。 (4)今后的课题 我们希望改良本技术，以便在再生医疗和细胞治疗的现场使用。 特别是对医疗现场使用的细胞，导入新物质，开发新的制药(细胞注入液)是值得期待的。 (5)研究者的评论 今后，希望将各种功能性高分子导入细胞内，致力于细胞的功能控制和新的细胞种类的开发。 另外，除了粘着性细胞外，对开发向浮游性细胞导入物质的技术也很感兴趣，期待对本项目感兴趣的企业和研究机构的咨询。 (6)用语解说 ※1电渗流:通过施加电压诱发液体流动的现象。 是在液体和固体相接的界面发生的现象，特别容易在纳米尺度的微小结构体中发生。 ※2内吞:物质进入细胞内的现象。 物质和细胞膜发生相互作用，通过膜的形态变化被吸收。 ※3 HeLa细胞:来自人类的癌细胞。 作为一般的培养细胞，在基础研究中得到了广泛的应用。 ※4 NIH3T3细胞:来源于小鼠胎儿的皮肤细胞。 作为一般的培养细胞，在基础研究中得到了广泛的应用。 ※5转染率:将核酸导入细胞内，使目标物质表达的比例。 (7)研究资助 科学研究费补助金基础研究b 科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业的先驱“电子离子控制型生物电子学”( JPMJPR20B8 ) 科学技术振兴机构( JST )研究成果展开事业SCORE大学推进型“高效的细胞内物质导入印章和显微镜搭载系统的事业化验证”( JPMJST2053 )