自体T细胞药物产品的制剂考量因素

前言

T细胞过继疗法目前已成为一种公认的抗癌免疫疗法，尤其在血液肿瘤表现出卓越的治疗潜力。通过设计嵌合抗原受体（CAR）或αβ-T细胞受体（TCR）转基因，编码到载体（如慢病毒）中，用于T细胞的转导。2017年，美国食品药物监督管理局（FDA）首次批准了两种CAR-T疗法，即tisagenlecleucel（Kymriah®）和Axicabatagene ciloleucel（Yescarta®），分别用于治疗急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。到目前为止，已有5种CAR-T疗法得到了批准。

CAR-T/TCR-T细胞制造的关键步骤包括：采集患者外周血单个核细胞（PBMC）、用抗CD3/抗CD28抗体富集T细胞、病毒介导的体外转导和扩增、冷冻保存和运输以及制剂和剂量的考虑。这五个属性将包括在药品开发质量指南Q8（R2）中提到的质量目标产品简介（QTPP）中，随着临床医生对癌症治疗方案的日益了解，这五个属性可能在I期和III期临床试验之间发生变化。

随着越来越多的CAR-T细胞疗法的市场批准，可以对其制剂设计和给药方式进行比较。这些数据有助于指导未来更多自体T细胞药物产品的生产和性能优化。

T细胞剂量

向患者输注后，CAR-T细胞在体内继续增殖，并在一些患者体内持续存在4年，与持续功能性的治疗效果相关。市场上销售的CAR-T细胞疗法的药代动力学曲线通常显示1-2周时的峰值水平（Tmax），总药物暴露量（AUC_0-28d）和最大峰值浓度（Cmax）。CAR-T细胞剂量优化的第一阶段临床试验设计仍然是一个有争议的话题，但通常涉及3+3剂量递增的变化，例如，在抗CD19 CAR-T细胞的I期研究中，10名复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者接受了2.5×10⁷（n=3）、5×10⁷（n=4）和1×10⁸（n=3）CAR-T细胞的递增剂量。下表显示了五种FDA批准的CAR-T细胞疗法的剂量、主要容器和填充体积。

TCR-T细胞治疗可能需要填充几个袋子，因为剂量（细胞数量）至少要大一个数量级。例如，在深圳第二人民医院最近进行的一项临床试验中，四名非小细胞肺癌患者接受NY-ESO-1的TCR-T细胞剂量范围为1.67-10.60×10⁹（中位数为7.16×10⁹细胞，转导效率36.6-96.6%），静脉输注1-3天。通过对上述剂量、填充量和主要容器的粗略比较，很明显，制剂在满足QTPP的制剂设计方面的选择相对有限，即冷冻袋/小瓶中的冷冻保存，静脉输液T细胞浓度范围为10⁶–10⁸ /mL。

生产自动化

从癌症患者获得的PBMC的质量和数量将受到疾病进展、免疫功能和暴露于导致淋巴细胞减少的化疗药物的影响，它们的特性将反过来影响T细胞的转导效率、增殖、表型（效应/记忆、CD4+/CD8+比率等）以及最终可制造的剂量。因此，自体T细胞的常规制造仍然非常具有挑战性。

上述的关键制造步骤需要复杂而漫长的工作流程，以天到周为单位。简化T细胞制造过程是降低T细胞疗法商品成本（COG）的重要策略。这推动了制剂和填充-完成步骤朝着全自动或半自动方向的发展。

根据良好生产规范（GMP），在ISO14644-1 7级洁净室（相当于FDA 10000级和欧盟C级）运行的无菌产品的封闭端到端工作流程明显优于ISO 14644-1 5级洁净室中需要密集手动步骤的开放流程（相当于FDA 100级，约等于欧盟A级）。更先进的培养设备实现了完全封闭、自动化的端到端过程，这已在美国国立卫生研究院临床中心得到实现，该中心为I/II期临床试验提供TCR-T细胞。一份报告显示扩增10天后，获得2.9（±0.7）×10⁹个T细胞（含CAR转基因慢病毒的转导效率为55%，存活率为96.5%，CD3+T细胞为98%）。

在扩增并对原药中的有核细胞（TNC）总数进行计数之后，制剂步骤涉及细胞浓缩/洗涤和再悬浮/稀释到含有二甲基亚砜（DMSO）的最终缓冲液中，使其达到药品的目标TNC浓度。在手动过程中，目标TNC/mL值可以通过必要的再悬浮/稀释步骤很容易达到。而在一个封闭的自动填充-完成过程中，需要通过原药的TNC/mL值计算细胞浓度和稀释步骤，以满足药物产品的目标TNC/mL。去除掉用于质控的药品外，其余药物按填充袋的参考有效填充体积分装。通过转导效率计算CAR/TCR阳性T细胞的数量，该值应符合治疗剂量，并在药品标签上列出。T细胞药品需要满足放行规格，如下表所列。

填充-完成

蠕动泵在硅胶管的支撑段内产生流动，该硅胶管是一次性使用装置（SUS）的一部分，是维持封闭端到端T细胞过程的方便解决方案。所有管道、过滤器、接头和袋子都经过预消毒，封闭式灌装-精加工工作流程可确保ISO 14644-1 7级（最低）洁净室中的产品质量。

蠕动泵在硅管中产生精确、无脉动的流动，可将大体积范围的药物产品装入不同大小和数量的袋子中。可能将空气从大体积袋带入药品袋仍然是一个问题，可以考虑监测袋重。缓冲成分的混合效率需要注意，因为辅料浓度必须保持在药物开发研究期间规定的配方设计空间内。DMSO的浓度可以通过比较制剂步骤前后和解冻后的渗透压和T细胞质量/数量来确定。

主容器选择

主容器是与药品直接接触的容器，对于目前上市的CAR-T产品，主容器是能够承受低温储存的袋子或小瓶。目前的首选似乎是乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）或聚烯烃袋，其中有多家制造商。这与聚氯乙烯（PVC）作为血液制品（如红细胞）低温袋材料的长期使用不同，常用的PVC增塑剂是邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）。DEHP已被证明是有争议的，因为它会渗入血液制品中，尽管它的存在会稳定红细胞膜，但它是一种已知的致癌物和内分泌干扰物，对人类和环境都有影响。长期提取增塑剂也会降低PVC的柔韧性，因此，PVC不适合作为T细胞的主容器材料。

EVA可渗透气态CO₂和O₂，这是在T细胞填充-完成步骤和给药之间维持细胞代谢和活力所必需的。对于水蒸气，渗透系数分别比CO₂和O₂大3到4个数量级。相比之下，PVC和PE对水蒸气、CO₂和O₂的渗透性较低。

主容器必须足够坚固，能够承受运输条件下的低温，以及解冻至环境温度。虽然文献中不经常报告，但袋故障确实会发生。Mele等人报告了377袋外周血祖细胞（PBPC）的破裂率为1.06%（4袋）。在四个袋子中，三个在从液氮罐中取出的过程中破裂，一个由于意外损坏。Khuu等人记录了体积为25–75 mL PBPC或淋巴细胞药物产品的EVA袋故障率， 2000-2002年三年的故障率分别为1.7%（10/599）、9.6%（58/605）和0%（0/177）。高故障率归因于来自一个供应商的特定袋批次，而不是产品类型、配方、储存或冷冻所致。

颗粒物、可提取物和可浸出物

通过采用SUS进行T细胞处理，消除了工艺转换和清洁/蒸汽产生的潜在污染，但SUS材料必须具有更好的性能、纯度，并且实际上不含微粒。可提取物是指在极端条件下从SUS中释放出来的化学物质，包括在药品保质期内迁移出去的可浸出物。

颗粒物同样受到监管机构的控制，因为如果注入，它们有可能阻塞血管并损害组织/器官，具体取决于其大小、形状、成分和数量。尽管SUS是在洁净室中生产的，但不能排除在药品填充过程中微粒粘附在塑料薄膜上并随后被带入主容器的可能性。美国材料与试验协会（American Society for Testing and Materials）提出了与用水或水加盐冲洗SUS表面颗粒以生成定量分析悬浮液相关的行业标准化方法。

细胞药物产品的冻融

冷冻速率是在给定DMSO浓度下控制冰核形成和生长的方法。然而，。目前尚未就T细胞药物产品的首选冷冻模式达成共识，运输或储存期间降低温度漂移风险需要逐案评估。弗劳恩霍夫研究所（IBMT）开发了一种新型机器人系统，能够在“IBMT培养基I”（10% DMSO和1% Poloxamer18）中精确地循环冷冻PBMC的温度，浓度为107个细胞/ml。在-135°C和-60°C两个温度循环之间循环400次，保持了更高的PBMC活力和抗原特异性T细胞反应。

T细胞产品完全解冻后应立即输注，无需进一步稀释。这就提出了如何最好地继续解冻步骤的问题，因为存在多个选项。理论上，应避免缓慢解冻，以防止去玻璃化，即加热速率低于临界升温速率时，无定形冰内形成冰晶。此外，必须确保加热的均匀性，以防止热应变导致物理应力。

DMSO对细胞的物理效应

DMSO是一种高效的细胞冷冻保护剂，但具有细胞毒性作用，因此需要从分子水平了解其对脂膜和细胞内大分子的作用。DMSO分子与二棕榈酰磷脂酰胆碱相互作用的分子动力学模拟表明，DMSO插入脂质头基团下方，破坏脂质-脂质排列，降低双层刚性，促进膜融合。因此，在冷冻和/或解冻过程中，细胞器和细胞膜的结构变形可以更容易适应，这是DMSO低温保护作用的一个关键机制。

DMSO对T细胞制剂具有较高的渗透压：即使是低浓度5%v/v的DMSO也相当于704mOsmol/kg，这明显高于血液。因此，T细胞制剂渗透压的测量应在药品更广泛的分析特性范围内。

新型赋形剂和T细胞制剂

DMSO具有潜在毒性，因此基于对DMSO使用的担忧，人们在积极地寻找替代性低温保存剂。许多研究小组已经开发了多种赋形剂的组合，其中一些单独用于上市药物，特别是与T细胞冷冻保存相关的赋形剂组合。

用于细胞冷冻保存的商用无DMSO培养基的数量惊人地多，虽然大多数是无血清的，或化学级别的，但很少有“GMP级”，并且几乎没有可以应用于T细胞系的证据。一个例外是Stem CellBanker®，它用丙二醇（10%）代替DMSO，已经用Jurkat细胞系进行了测试，并具有公认的FDA文件。然而，用丙二醇或甘油替代DMSO并不能缓解高渗压或体内毒性的担忧。EMA发布了一份关于丙二醇作为静脉给药辅料的文件，包括儿童和成人的耐受性和建议限值。

小结

目前，全球多达上千项关于CAR-T或TCR-T细胞疗法处于临床开发阶段，CAR-T细胞的产品质量也更多的受到人们的关注。从制剂的角度来看，未来需要解决的目标包括更大范围的细胞剂量和浓度、更优的主容器和不同T细胞表型的共同制剂。为了支持这些目标，有必要推进冷冻保存的研究，以便降低渗透压、细胞毒性和非水溶剂暴露时间，同时提高对不同冷冻速率的耐受性。塑料性能的进步将提高容器在超低温下的坚固性，新的焊接/密封工艺将提高SUS设计和组装的灵活性。

FDA最近表示，“到2025年，我们预计FDA将每年批准10到20种细胞和基因治疗产品”，并将“最大限度地利用我们的加速项目，包括再生医学高级治疗（RMAT）的指定和加速批准”。根据目前的批准，自体T细胞免疫疗法将是这些细胞和基因治疗产品的主要部分，并且制剂设计将在确保它们到达患者体内方面起着关键作用。

参考文献：

1.Formulation Considerations for Autologous TCell Drug Products. Pharmaceutics. 2021 Aug; 13(8): 1317.