塑料降解酶的发掘与蛋白质工程
到2050年，预计将有约1200亿公吨塑料废物堆积在垃圾填埋场和自然环境中，塑料废料处理不当将会造成了巨大的环境挑战。塑料废物，特别是微塑料可能对各种生物造成危害。废塑料的数量急剧增加，造成了环境危机，需要创新的技术来回收消费后的塑料。酶介导的生物催化解聚反应已成为塑料处理和回收的有效和可持续的替代方法。截至目前，已经发现了多种从微生物来源的可降解塑料的酶，同时已经利用蛋白质工程来修饰和优化塑料降解酶。
塑料降解酶的发掘
图1
（1）传统方法
如图1A所示在传统的筛选方法中，是以塑料为底物将微生物进行培养来筛选具有降解塑料能力的微生物，然后对具有降解能力的微生物进行进一步的鉴定。但是，依赖于培养物的方法严重限制了发现新的可降解塑料酶的范围，因为据估计，目前已培养的微生物总数不到1%。
（2）基于宏基因组测序的方法
使用宏基因组学发现可塑性降解酶的总体工作流程如图1B所示。在这些步骤中，选择合适的筛选方法对于宏基因组学的挖掘至关重要。通常，有两种常用的方法，以序列为基础的筛选和以功能为基础的筛选。基于序列的筛选通过搜索生物信息数据库来利用序列相似性比较和功能基因注释。但是，其成功受到已知可塑性降解酶的当前数据库的大小和基因注释质量的限制。这种方法也可能会错过与先前表征的序列相比具有较低序列相似性的新的塑料降解酶家族。此外，序列相似性不能保证塑料降解活性，因此需要进一步表征和验证酶功能。
基于功能的筛选使用活性测定法从宏基因组库中搜索所需的表型。在挖掘完全新的酶时，这种方法与基于序列的筛选相比特别有利，因为该组酶的序列与现有同源酶的序列差异更大。传统的琼脂平板测定法筛选大型宏基因组文库的能力有限。开发高通量筛选方法可能会加快新型塑料降解微生物和酶。当使用功能筛选方法时，重要的是选择合适的宿主细胞和构建文库的规模及覆盖度。
宏基因组学方法已成为探索来自各种环境来源的绝大多数微生物的有力工具，目前已经从许多环境宏基因组样本中检索到许多编码能够解聚不同塑料材料的酶的基因。如下表1所示：
表1
（3）基于蛋白质组的方法
基于蛋白质组学的方法是直接检测分析表达的蛋白，图1C显示了蛋白质组学方法用于挖掘可塑性降解酶的常用工作流程。首先，在有或没有塑料底物的情况下培养纯净的或环境微生物菌群，因为塑料的存在可以差异性地诱导功能性微生物表达具有塑料水解活性的酶。提取微生物培养物产生的蛋白质并将其消化成小肽，然后进行测序，然后通过生物信息学分析鉴定蛋白质。
比较蛋白质组学最常用于开采可降解塑料的酶，其前提是与塑料一起孵育会刺激与塑料解聚反应有关的酶的表达。蛋白质组学指导的可塑性降解酶的发现仍处于起步阶段，目前所有报道的研究都是使用纯微生物培养物进行的。通过代谢组学从复杂环境样品中直接鉴定降解塑料的酶仍然具有挑战性，因为难以进行高质量的蛋白质提取，并且下游生物信息学分析数据库的可用性有限。
塑料降解酶的蛋白质工程
利用蛋白质工程技术来改善塑料降解酶的催化性能是最近出现的话题。蛋白质工程一般有两类方法：合理的设计和定向的进化。合理的设计基于蛋白质结构和机械特性，计算仿真和建模的知识来修饰目标蛋白质。关于工程塑料降解酶的最新报道几乎都采用合理的设计，因为许多这类酶都具有可用的结构和机理信息。缺乏有效的高通量筛选技术是塑料降解酶定向进化的主要障碍。
目前关于塑料降解酶的蛋白质工程主要集中在以下四个方面（图2）：
1、塑料降解酶的热稳定性是非常需要的。当反应温度接近或高于塑料的Tg时，聚合物链将具有显着增加的柔韧性和流动性，从而促进它们与酶表面的结合以及对活性位点的可及性，从而提高降解效率。已设计出有效的策略来提高可塑性降解酶的热稳定性，如下所述：引入二硫键或盐桥可能有利于增强塑料降解酶的热稳定性；在负责更稳定酶结构的区域形成氢键是获得增强的热稳定性的另一种方法；引入更多的脯氨酸残基也可以增加塑料降解酶的热稳定性；对于在真核微生物细胞中表达的可塑性降解酶，糖基化的引入也可以潜在地改善热稳定性。
2. 活性位点区域是工程塑料降解酶的热点，因为酶活性位点和底物之间的相互作用是决定塑料解聚效率的关键因素。一种常见的策略是在活动位置创建一个更宽的开口，以增加塑料底物的可及性；活性位点的底物结合凹槽的疏水性也是潜在的工程目标，增加疏水性对于塑料底物的结合可能是有利的。
3. 通过增强酶与底物之间的相互作用，有效地利用可塑性降解酶的表面性质，也可以提高生物催化效率。底物结合过程取决于底物分子与酶表面氨基酸残基之间的静电和疏水相互作用，因此，改变表面静电或疏水特性是常见的策略；增强底物与酶相互作用的另一种方法是将结合附件融合到酶表面。
4. 在塑料降解酶功能的其他方面也已进行了努力，包括降低产物抑制作用；实现酶的催化混杂以及创建多功能生物催化剂；开发了塑料降解酶与另一种辅助酶的融合以产生双功能生物催化剂以提高解聚效率。
图2
参考文献：
Zhu B, Wang D, Wei N. Enzyme Discovery and Engineering for Sustainable Plastic Recycling. Trends Biotechnol. 2021 Mar 3:S0167-7799(21)00040-8. doi:10.1016/j.tibtech.2021.02.008. Epub ahead of print. PMID: 33676748.
供稿：王琦
编辑：张彤 徐娅 李晓萌
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