重大突破！王皓毅团队首次在体外模拟了人类X染色体的随机失活
近日，中国科学院动物研究所，干细胞与生殖生物学国家重点实验室，干细胞与再生医学创新研究院王皓毅研究员团队应用人类原始态（naive）胚胎干细胞首次在体外模拟了人类X染色体失活。
北京时间2020年7月15日晚23时，该研究论文刊登于《细胞—干细胞》。
未来论坛青年理事王皓毅发布朋友圈并表示：“这个工作做了六年，终于发表了，是我回国之后比较满意的一个工作，解答了之前困扰我的几个问题，也使得人类的X染色体失活有了一个研究模型。希望我们接下来能利用这个模型做出一些真正重要的发现，回答X染色体失活领域里面的核心问题。
安辰瑞是我刚回国招收的第一个博士生，能一直坚持做这个课题，很不容易，感谢他的努力和坚持！也非常感谢冯桂海老师在生物信息分析方面给予的强力支持与合作。感谢陆发隆老师的合作，更要感谢周琪老师的合作和一直以来的支持！”
在许多动物中，性别由个体所具有的性染色体（X和Y染色体）决定：雄性拥有一条X染色体和一条Y染色体（XY），而雌性则携带两条X染色体（XX）。雌性个体拥有的X染色体比雄性多一条，因此在胚胎早期发育过程中，雌性的一条X染色体会发生失活，即这条染色体上大部分的基因都会关闭。该过程就像一个“天平”，需要平衡雄性和雌性X染色体之间的基因表达水平，而X染色体失活（X Chromosome Inactivation，XCI）则是这一过程中的“砝码”，雌性细胞的一条X染色体会表达一种长非编码RNA（XIST），XIST包裹这条X染色体，并招募多种参与染色质重塑的蛋白进而失活该染色体。一个有趣的例子是母三色猫的斑驳毛色就是X染色体失活的表现，产生“黑色皮毛”和“橙色皮毛”的等位基因分别位于两条不同的X染色体上，由于早期胚胎发育过程中不同的细胞会随机选择一条X染色体进行失活，因此不同毛皮细胞保留的具有活性的X染色体不同，从而导致不同毛色斑驳嵌合的现象（图1）。
XCI是雌性哺乳动物早期胚胎发育过程中的一个关键事件，其正常起始、完成和维持对于胚胎正常发育至关重要。人类的X染色体上有大约一千个基因，其中很多基因都参与重要的生理功能，研究人类XCI对于理解人类胚胎发育具有重要价值。同时，由于X染色体相关基因突变、XCI偏移、以及性染色体非整倍性等原因造成多种X染色体相关疾病，如血友病（Hemophilia）和蕾特氏症（Rett Syndrome），因此，人类XCI过程及机制的揭示对于相关疾病治疗的研究具有极其重要的意义。
在约60年的XCI研究中，小鼠一直是主要的研究模型。小鼠胚胎干细胞（Mouse embryonic stem cells，mESCs）具有两条激活的X染色体且没有Xist表达，其状态与小鼠着床前囊胚内细胞团一致，并在体外分化后可完成随机XCI，进而成为XCI研究的高效工具。然而，近年很多证据表明小鼠和人类早期胚胎X染色体状态以及XCI过程存在巨大差别。在人类女性着床前胚胎的内细胞团中，两条X染色体维持激活状态，同时双等位基因表达XIST（图2），这与小鼠早期胚胎以及mESCs的状态都显著不同，这一物种间差异凸显：要真正理解人类XCI的过程和机制，需要建立基于人类细胞的研究模型。
从内细胞团分离的常规培养的人类胚胎干细胞（Human embryonic stem cells，hESCs）与原始态多能性（naïve pluripotency）的mESCs不同，呈始发态多能性（primed pluripotency），当前体外培养的primed hESCs大多已完成XCI，且XCI状态不稳定并具有异质性，使其无法作为人类XCI的有效研究工具。近年来，人类原始态多能性（naive pluripotency）胚胎干细胞的建立获得了两条X染色体激活的hESCs。然而，大部分细胞仅在一条X染色体上表达XIST，与人类早期胚胎不一致。更重要的是，在分化后细胞无法完成随机的XCI。因此，目前研究人类X染色体调控和随机失活仍缺少理想模型，使这一人类重要发育事件的研究严重滞后。
2020年7月15 日，中国科学院动物研究所、干细胞与生殖生物学国家重点实验室、干细胞与再生医学创新研究院王皓毅团队在Cell Stem Cell上发表了题为“Overcoming autocrine FGF signaling-induced heterogeneity in naive human ESCs enables modeling of random X chromosome inactivation”的最新研究成果。该研究发现在人类胚胎干细胞系naïve多能性诱导培养过程中多能性和X染色体状态存在显著异质性，并证明该异质性产生原因在于未完全阻遏内源性自分泌FGF2。研究者们通过鉴定分离其中一个细胞亚群，获得了更为接近人类着床前早期胚胎的同质性naïve hESCs。在后续的分化过程中，首次在体外模拟了人类X染色体的随机失活（图3）。该模型为人类XCI的研究提供了高效的平台，并为X染色体相关疾病的攻克打下坚实的基础。
研究者将绿色（GFP）和红色（tdTomato）荧光蛋白分别插入X染色体基因MECP2中，在的primed多能性状态下，已发生XCI的hESCs呈单绿色。通过流式细胞分析naïve多能性诱导过程，发现tdTomato被快速激活。然而，逐渐出现两群具有荧光表达差异的细胞：一群细胞高表达tdTomato，一群低表达tdTomato（图4）。
图4A：通过TALEN基因编辑技术建立携带X染色体串联双荧光报告系统的primed人类胚胎干细胞系。图4B：primed hESCs以及naive诱导过程中细胞的明场和荧光图片。图4C：流式细胞检测及分析诱导过程。图4D：统计分析流式细胞检测结果
在分离鉴定后发现，两群细胞的两条X染色体均呈激活状态。然而，高表达tdTomato的细胞在双等位基因上表达XIST，并相对高表达naïve特异性基因（如TFCP2L1），因此命名HT naïve hESCs （Highly expressing tdTomato andTFCP2L1）。而另一群细胞仅在一条X染色体上表达XIST，且较低表达naïve特异性基因，故命名LT naïve hESCs （Lowly expressing tdTomato and TFCP2L1）（图5A，B）。而后通过RNA-Seq测序分析发现，相对于primed hESCs，HT naïve hESCs的转录组更接近人类着床前早期胚胎，而LT naïve hESCs介于两者之间（图5C）。
图5A：平均荧光强度定量NANOG，REX1以及TFCP2L1的表达水平。图5B：HT和LT naive hESCs中XIST（红色），XACT（绿色）和ATRX（黄色）的表达。图5C：HT和LT naive hESCs的RNA-Seq数据，与人类早期胚胎的单细胞RNA-Seq数据比较(Petropoulos et al., 2016)
接着，通过分析RNA-Seq数据以及ELISA检测，发现LT细胞高表达FGF2，并分泌该因子在培养基中；在完全阻遏FGF受体后，LT细胞可转变成HT细胞，进而证实内源性自分泌的FGF2是造成naïve多能性和X染色体异质性的重要因素（图6）。
图6A：ELISA定量分析LT和HT naive hESCs培养上清液中FGF2和FGF4的蛋白浓度。图6B：LT和HT naive hESCs MEK/ERK信号通路下游应答基因表达水平比较
研究者将HT naïve hESCs重新分化为primed多能性后，细胞发生了随机的XCI，而仍有一部分细胞保持两条X染色体呈激活状态（图7）。
图7A：流式细胞分析HT和LT经过repriming后荧光状态。SG：单绿色（single GFP positive）；ST：单红色（single tdTomato positive）；TG：双阳性（double positive）。图7B：Re-primed hESCs中XIST（红色）, XACT（绿色）以及ATRX（黄色）的表达
在进一步分化这些未发生XCI的primed hESCs后，所有细胞均完成了XCI（图8）。特别值得指出的是，研究中在采用不同的分化方法时会影响细胞选择不同X染色体进行失活的比例，其中一种特定的分化方法可以实现两条X染色体近乎随机的失活，也是第一次在细胞模型中实现可控的人类X染色体随机失活（图8）。
图8A：流式细胞分析re-primed hESCs以不同方法分化的成纤维细胞GFP和tdTomato阳性细胞的分群。图8B：Re-primed hESCs分化的成纤维细胞XIST（红色）以及ATRX（黄色）的表达以及H3K27Me3（绿色）。图8C：热图显示分化的成纤维细胞中X染色体SNPs的等位基因表达，依据包含SNPs位点的reads数
据了解，该论文第一作者安辰瑞是王皓毅研究员刚回国招收的最早的博士生之一，这一工作经过了六年的研究完成。本论文在投稿Cell Stem Cell杂志期间得到了多位审稿人的高度评价，审稿人认为“该研究分离naïve hESCs亚群，并鉴定在分化后可起始随机XCI，进而建立了一个研究人类XCI的宝贵平台（Wang et al presenta valuable resource for studying human X chromosome inactivation (XCI) processby isolating a specific subpopulation of naïve hESCs that were able to initiaterandom XCI upon differentiation.）”，“该研究平台首次在体外模拟了人类X染色体的随机失活（This article introduces an improved resource to studythe process of XCI in humans, as these cells seems to be the first in vitromodel in human reported to experience random XCI.）”，“该研究指出，内源性自分泌的FGF2的表达会明显影响naïve hESCs的诱导和培养，为今后优化naïve 多能性培养体系及降低细胞异质性提供了重要线索（In addition, the articlereveals important consequences of FGF2 expression on naïve cell cultures, whichcould benefit the community in the effort of improving the conversion towardshuman naïve pluripotency and reducing their heterogeneity.）”，“该平台的建立首次实现了干细胞领域长期追求的目标，填补了由于缺乏合适研究模型所造成的X染色体研究空白（These findings are importantbecause they demonstrate for the first time that random XCI can be adequatelymodeled using naïve hESCs, which has been a long-sought goal of the stem cellfield.）”。
综上所述，该模型的建立对于研究人类XCI的过程和机制有着重要意义。在后续研究中，利用该模型可验证XCI相关基因在人类细胞中的功能，更重要的是利用该体系结合基因编辑技术可以对XCI起始，完成和维持相关的基因及信号通路进行高通量基因筛选，以揭示人类XCI的进程及机制，并为X染色体相关疾病的治疗提供新的思路和理论基础。
据悉，中国科学院动物研究所博士研究生安辰瑞、副研究员冯桂海为论文共同第一作者。中国科学院动物研究所、干细胞与生殖生物学国家重点实验室、干细胞与再生医学创新研究院王皓毅研究员为本文的通讯作者。同时该研究也得益于中国科学院动物研究所、干细胞与生殖生物学国家重点实验室、干细胞与再生医学创新研究院周琪院士、中国科学院遗传与发育研究所陆发隆研究员的大力合作。
关注未来论坛
一个承载人类科技梦想
用科学改变未来的公益平台
一个连接前沿科技
解读未来趋势的思想平台