定坤丹对肾阳虚证薄型子宫内膜不孕症的临床干预及其调控Wnt/β-catenin信号通路的作用机制研究

目的:1.探讨定坤丹在诱导排卵周期治疗薄型子宫内膜不孕症患者的临床疗效,分析中成药定坤丹在辅助助孕方面的功效,以期为薄型子宫内膜不孕症患者提供一种简便有效的治疗方法。2.通过动物实验建立肾阳虚薄型子宫内膜大鼠模型,观察定坤丹对雌性大鼠血清激素水平、子宫内膜厚度及Wnt/B-catenin信号通路上子宫内膜相关标记物的调控作用,探讨定坤丹治疗薄型子宫内膜的药效机制和作用靶点。方法:1.选择在江苏省中医院生殖医学科门诊就诊的薄型子宫内膜不孕症患者,将筛选合格的120例患者采用随机数字法分为定坤丹组,补佳乐组,联合用药组(定坤丹+补佳乐),每组40例。在诱导排卵(LE+HMG+HCG)周期治疗的基础上各治疗组均在月经周期第9d开始用药,均连续口服15d。其中定坤丹组服用定坤丹10.8g/次,每日2次;补佳乐组补佳乐1mg/d;联合用药组同时服用补佳乐以及定坤丹。三组患者均在排卵后服用达芙通20mg/d×14d。观察3个月经周期。对比各组治疗前后患者月经量的变化、中医证候积分、子宫内膜厚度、子宫内膜形态和血流分级、子宫内膜容积、子宫动脉血流参数(VI、FI、VFI)以及促排卵结果(HCG日E2水平、排卵率、妊娠率等)等。2.选取性周期规律的SD雌性大鼠,按随机数字表法分为空白组、模型组、定坤丹组、补佳乐组、联合用药组,每组各8只。除空白组外,其余各组建立肾阳虚薄型子宫内膜模型,即采用手术方式使用95%乙醇对大鼠子宫内膜进行化学损伤,并于术后次日灌胃给予羟基脲悬浊液450mg·kg-1·d-1,连续8 d。术后次日,空白组自由饮水摄食,模型组予蒸馏水灌胃,其余各治疗组分别给予补佳乐、定坤丹、补佳乐+定坤丹灌胃。三个动情周期后,ELISA法检测血清E2、LH、P OPN、VEGF、MMP-9水平;HE染色观察子宫内膜组织形态学变化;免疫组织化学分析动情期大鼠子宫内膜组织CK19、Vimentin、VEGF的表达情况;RT-PCR技术定量分析实验大鼠子宫内膜β-catenin、VEGF以及MMP-9 mRNA表达特征;Western-blot法检测各组大鼠子宫内膜中β-catenin、VEGF以及MMP-9蛋白的表达。结果:1.临床研究:月经量的变化:本组治疗前、后比较,定坤丹组、补佳乐组以及联合用药组月经失血图评分增幅分别为14.05±4.80、10.15±3.50、15.25±5.30,均具有显著统计学差异(P<0.01);定坤丹组、联合用药组与补佳乐组比较增幅更大(P<0.01)。中医证候积分:本组治疗前、后中医证候积分比较均具有明显统计学差异(P<<0.01);定坤丹组、联合用药组治疗后与补佳乐组比较均具有明显差异(8.75±6.44 vs 12.35±5.6,P<0.05;6.64±6.16 vs 12.35±5.6,P<0.01)。子宫内膜厚度:本组治疗前、后比较,定坤丹组、补佳乐组以及联合用药组子宫内膜厚度增幅分别为1.97±0.36mm、2.03±0.47mm、2.43±0.64mm,均具有显著统计学差异(P<0.01);定坤丹组与联合用药组治疗后内膜厚度比较有统计学差异(P=0.027);子宫内膜形态:定坤丹组、联合用药组A型子宫内膜所占比例与本组治疗前、后比较均明显增多(22.5%vs45.0%,P<0.05;15.0%vs57.5%,P<0.01)。子宫内膜容积:治疗后各组子宫内膜容积≥2.0ml比例明显增多,定坤丹组由10%上升为57.5%,补佳乐组由15%上升为72.5%,其中,联合用药组所占比例最多,达到77.5%,但组间无差异(P>0.05)。子宫内膜血流分级:内膜血流Ⅲ级所占比例本组治疗前后比较,定坤丹组、补佳乐组均增多(分别为22.5%VS7.5%、12.5%VS 5.0%),但无统计学差异(P>0.05),联合用药组明显增多(35.0%vs 0.0%,P<0.01)。子宫动脉血流参数:子宫内膜下血流参数(VI、FI、VFI),治疗后各组均显著增多,差异均显著(P<<0.01);治疗后各治疗组血流参数VI均较治疗前增多;定坤丹组、联合用药组与补佳乐组比较,VI均增多(分别P=0.005;P=0.004)。促排卵结果:HCG日E2水平,定坤丹组低于补佳乐组、联合用药组(均为P<0.01);补佳乐组低于联合用药组(P=0.026)。定坤丹组与联合用药组临床妊娠率比较(22.5%VS 52.5%),具有显著统计学差异(P=0.006),临床疗效比较:定坤丹组与联合用药组痊愈率分别为22.5%、50%,具有显著统计学差异(P=0.011),定坤丹组显效率高于联合用药组,具有统计学差异(P<0.05)。2.实验研究:血清学检测:与空白组比较,模型组及各治疗组大鼠血清E2水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,补佳乐组与联合用药组大鼠血清E2水平差异有统计学意义(分别为P<0.01,P<0.05);实验各组大鼠血清LH水平比较均无明显差异(P>0.05);与空白组比较,模型组及各治疗组大鼠血清P均呈不同程度的升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与空白组比较,模型组血清OPN、VEGF、MMP-9水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,定坤丹组血清OPN、MMP-9水平降低(分别为P<0.05,P<0.01);联合用药组血清MMP-9水平降低(P<0.01)。与补佳乐组比较,定坤丹组血清OPN水平低于补佳乐组(P<0.05);与联合用药组比较,定坤丹组血清OPN水平更低,而MMP-9水平更高(均为P<0.05)。子宫内膜形态学及内膜厚度:与空白组比较,模型组子宫内膜层基质细胞减少,腺体、血管稀疏,内膜明显变薄(P<0.01);与模型组比较,各治疗组腺体、血管增多,基质细胞密集,内膜均明显增厚(P<0.01)。免疫组化检测:与空白组比较,模型组CK19表达面积明显减少(P<0.01)。与模型组比较,定坤丹组CK19表达面积明显增多(P<0.05),补佳乐组与联合用药组CK19表达面积显著增多(P<0.01);与空白组比较,模型组Vimentin的IOD值降低(P<<0.05),联合用药组Vimentin的IOD值显著升高(P<0.01);与空白组比较,模型组子宫内膜VEGF的AOD值显著降低(P<0.01);与模型组比较,定坤丹组、联合用药组子宫内膜VEGF的AOD值呈不同程度的升高(P<0.05,P<0.01)。RT-PCR检测:与空白组比较,模型组大鼠子宫内膜β-catenin、MMP-9 mRNA明显升高(P<0.05),而VEGF mRNA明显降低(P<0.05);补佳乐组及联合用药组MMP-9 mRNA明显降低(P<0.05);与补佳乐组比较,定坤丹组MMP-9 mRNA升高(P<0.05);与联合用药组比较,定坤丹组MMP-9 mRNA升高(P<0.05)。Western-blot检测:与空白组比较,模型组β-catenin、VEGF、MMP-9蛋白水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组β-catenin蛋白水平显著降低(P<0.01);定坤丹组与联合用药组MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.01)。与补佳乐组比较,定坤丹组β-catenin蛋白水平更高,MMP-9蛋白水平更低(分别P<0.05,P<0.01);联合用药组β-catenin、MMP-9蛋白水平均显著降低(P<0.01)。与联合用药组比较,定坤丹组β-catenin蛋白水平更高(分别P<0.01,P<0.05)。结论:1.定坤丹可调节植物神经和性腺轴的功能,并能提高E2水平,产生与雌激素相似的效应。2.定坤丹联合补佳乐能够增加薄型子宫内膜不孕症患者的月经量,改善肾阳虚证的症状,增厚子宫内膜内膜,增加A型内膜及血流Ⅲ级内膜比例,改善子宫内膜血流灌注,提高周期排卵率,降低周期取消率,优化妊娠结局。3.定坤丹可能通过提高肾阳虚薄型子宫内膜大鼠血清E2水平,降低血清OPN、MMP-9水平,增加损伤性大鼠子宫内膜组织CK19、Vimentin及VEGF表达,促进术后损伤性大鼠子宫内膜的修复与再生。4.定坤丹联合补佳乐通过上调多重损伤性大鼠子宫内膜β-catenin mRNA、VEGF mRNA表达,下调MMP-9 mRNA的表达,提高子宫内膜容受性。

5.定坤丹联合补佳乐通过上调肾阳虚薄型子宫内膜大鼠子宫内膜VEGF表达,下调β-catenin,MMP-9蛋白水平,促进损伤性子宫内膜的修复与重塑。...