假基因演化出调控人红细胞发育及疾病的全新调控机制
长期以来，通过基因重复诞生新基因被认为是物种进化的主要驱动力。然而，大多数重复基因在演化过程中会积累各种功能丢失突变从而产生假基因（Pseudogene）(图1)。其数量巨大（占已注释人类基因模型的1/4），通常被认为不具有生物学功能。然而，随着技术进步，假基因的功能在疾病中（尤其肿瘤中）已被逐步揭示【1,2】。但假基因在个体发育中的功能却知之甚少。另外，考虑到通过重复产生的若干人类特异蛋白编码基因已被证明参与塑造人类特有的生物学特征【3,4】，那么同样是通过重复产生的数量巨大的假基因，是否也在人类特异的生物学特征塑造中发挥重要作用呢？这一点并不为人知。
图1 假基因的不同起源（图片来源：Poliseno L. Sci Signal. 2012 Sep 18;5(242):re5.）
2021年1月20日，中国医学科学院基础医学研究所余佳研究组、中国科学院动物研究所张勇研究组、中国医学科学院血液病医院（血液病研究所）石莉红研究组在Developmental Cell杂志上发表了题为 Genome-wide analysis of pseudogenes reveals HBBP1's human-specific essentiality in erythropoiesis and implication in β-thalassemia 的文章。该研究系统性地分析了假基因在人类多组织中的表达特征及与人类疾病的关联，揭示了位于人β-珠蛋白基因簇中的假基因HBBP1 (又称η-globin) 在红细胞发育中发挥人类特异的关键调控作用并进化出不依赖母源序列的崭新调控方式，提出人类特异表达的假基因可能参与人类特异性状演化的新概念，并发现起源方式不同的假基因在作用方式上存在巨大差异，为假基因功能机制研究提供重要参考。
该研究工作首先在基因组水平上分析了假基因在人类多组织中的表达特征，发现与蛋白编码基因相比，假基因呈现出明显的组织特异表达倾向，并显著高表达于骨髓组织。全基因组关联分析发现假基因HBBP1中的3个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）均与人类红细胞疾病相关。假基因HBBP1位于红细胞中最为重要的功能基因簇--β-珠蛋白基因簇中，处于胎儿期γ-珠蛋白与成体期β-珠蛋白基因之间（图2）。HBBP1发现于1984年【5】，是最早鉴定的假基因之一。近年来HBBP1区多个SNP与血红蛋白疾病关联的报道【6,7】，引发HBBP1是功能性假基因的猜想。有报道指出HBBP1所在DNA序列参与β-珠蛋白基因簇高级构象维持，并参与调控个体发育过程珠蛋白表达开关【8】。但该假基因是否转录，转录本是否发挥功能，与疾病的关联等仍然未知。
图2 假基因HBBP1所在β-珠蛋白基因簇及HBBP1表达量分布
在该工作中，研究者首先明确了假基因HBBP1特异表达于红细胞，随红系分化表达显著上调（丰度超过99%的非蛋白编码基因）（图2），且不具备蛋白编码能力。由于HBBP1并不存在于小鼠基因组中，无法通过基因敲除小鼠进行功能研究，因此研究者在代表3个不同阶段人红细胞分化的体内/外系统中开展分析。系列实验均证明HBBP1是人红细胞发育成熟所必需，其缺失导致胚胎干细胞向红系分化能力的完全丧失（图3），在造血干/祖细胞中下调其表达显著抑制体内、体外红细胞分化进程。HBBP1剪接位点突变及转录本功能回补实验，进一步佐证了HBBP1通过转录本发挥功能。
图3 HBBP1缺失导致红系分化完全受阻
对HBBP1如何控制红细胞发育机制的进一步探索发现，HBBP1大量聚集于细胞质中，与红系发育关键转录因子TAL1 mRNA相互靠近，与之竞争性结合RNA结合蛋白（RNA binding protein, RBP）hnRNPA1。hnRNPA1与TAL1 mRNA结合可诱导其降解，但对HBBP1 RNA则无降解作用，因此HBBP1通过提高TAL1 mRNA稳定性维持红细胞正常发育。这里所揭示的HBBP1作用机制不同于通常的假基因作用机制，即通过与母基因共享功能序列来调控母基因的表达。HBBP1并不直接调控珠蛋白基因簇成员表达，且其发挥作用所依赖的hnRNPA1结合位点也不是从母基因复制而来，而是在进化过程中通过突变产生。进一步对该作用机制的普适性探索发现，以HBBP1为代表的重复假基因（Duplicated pseudogene）相对于逆转录假基因（Retroposed pseudogene） ，更倾向通过结合RBP发挥作用，且多数情况下其母基因并不结合同样的RBP；而逆转录假基因则更倾向于结合miRNA发挥作用，这与逆转录常以polyA尾启动从而保留了完整的3’端序列一致。因此该研究比较系统地展示了假基因作用机制的多样性及两类不同起源的假基因由于其突变起源机制所导致的作用机制上的差异；而假基因不依赖于母基因的新功能和调控机制正是假基因研究领域所忽视的。
HBBP1通过促进TAL1表达不仅维持了正常的红细胞分化发育，在血红蛋白疾病中亦具有重要保护作用。β-地中海贫血是一类由β-珠蛋白基因突变或缺失而引起的溶血性贫血，激活在成体期已经沉默的胎儿血红蛋白（Fetal hemoglobin, HbF）可有效缓解症状【9】。本研究工作发现HBBP1在β-地中海贫血患者中会代偿性升高，通过促进TAL1表达参与患者体内HbF活化及贫血症状缓解。另外，HBBP1在患者体内的表达量受HBBP1SNP基因型影响，解释了HBBP1 SNP与血红蛋白疾病症状关联的原因。
最后，该研究工作对假基因HBBP1的进化及在多物种中的表达分析发现，HBBP1虽然通过重复起源于有胎盘哺乳动物祖先，是一个古老的假基因，但在获得结合位点序列后的物种演化中呈现出复杂的多样性：在偶蹄类不同物种中分别作为蛋白编码基因和假基因；在啮齿类等中发生了丢失；在大多数灵长类中作为不表达的假基因、且在恒河猴中再次丢失结合位点，仅在人红细胞中获得了大量表达，并参与到了TAL1-hnRNPA1调控网络中，发挥人类特异的重要功能。该工作阐释了一个假基因从产生到消亡，并再次获得新生，发挥物种特异调控功能的过程，使我们得以窥见自然选择、物种进化的精彩动态（图4）。
图4 假基因HBBP1在序列、结合位点和表达水平上的进化途径
综上，该研究工作首次在全基因组水平揭示了假基因的表达特征、与疾病的关联及作用机制的系统性偏好，阐明假基因HBBP1的进化历程，解析其通过突变获得新结合位点作为RBP decoy发挥红细胞发育调控功能的机制（图5），从而提出假基因参与塑造人类特异的生物学特征这一新概念；这些结果为大量存在的假基因的研究带来新的认识并提供了重要参考。
图5 假基因HBBP1进化及作用模式图
中国医学科学院基础医学研究所副研究员马艳妮、博士刘思琪，中国医学科学院血液病医院助理研究员高洁，中科院动物所博士陈春燕，汕头大学医学院第一附属医院张昕研究员为该研究论文的第一作者。余佳研究员、张勇研究员、石莉红研究员为该论文的通讯作者。
专家点评
安秀丽（纽约血液中心）
红细胞发育调控机制是解析红细胞疾病的基石，也是体外实现红细胞再生的理论基础。余佳/张勇/石莉红联合团队跨领域合作，发挥了各自在RNA调控、基因进化、红细胞调控研究方面的优势和扎实基础，深入浅出地解析了假基因HBBP1的进化历程、全新的调控机制及在红细胞发育及疾病中的重要功能。该研究充分体现了学科交叉的优势，不仅发现了假基因HBBP1对红细胞发育的必需功能也揭示了其在血红蛋白疾病中的保护作用，还发现了假基因HBBP1新的调控机理并解析了其功能的起源过程。
假基因HBBP1对于红细胞领域研究者来说是“最熟悉的陌生人”，它是编码血红蛋白的β-珠蛋白基因簇的组成成员，但其功能却一直被忽视。该研究工作首次全面系统地阐明了假基因HBBP1的前世今生、表达特点、功能机制。该假基因对红细胞发育的必需性，令人印象深刻。它调控红系转录因子TAL1 mRNA稳定性的机制提示珠蛋白基因簇与红系转录因子间存在双向反馈调控机制，共同调控和平衡红细胞发育及血红蛋白合成。β-类血红蛋白疾病是世界上影响最广泛的单基因突变疾病，如何激活胎儿血红蛋白以治疗β-类血红蛋白疾病是本领域的研究焦点。该研究发现假基因HBBP1在β-地中海贫血患者中的遗传相关性及保护作用为β-地中海贫血干预提供了新的靶点。
在这个重要的工作基础上，进一步揭示假基因在造血发育及疾病中的功能，明确HBBP1在β-地中海贫血治疗中的可能作用，明确HBBP1人类特异的调控功能究竟为人类红细胞带来怎样的改变和优势，是否参与支撑了人类更加出色、持久的耐力，将是重要的研究方向，值得进一步探索。另外，正如该文所说，我们在关注那些肉眼可见的人类特异生物学特征（比如更大的脑容量）的同时，人类与其它物种在发育、疾病等方面的差异，比如红细胞发育的异同，也值得关注和思考。
专家简介
安秀丽，博士，教授，博士生导师。美国纽约血液中心膜生物学实验室主任。长期从事红细胞膜结构与功能以及干细胞向红系发育进程及调控机制两方面的研究，在系统阐明红细胞膜骨架的组成、结构及生理病理功能的基础上，建立了人类和小鼠红系分化发育各阶段的分离和鉴定体系，阐明了红系分化进程中基因组和表观基因组的动态变化，发现并鉴定了造血岛巨噬细胞的生物学特征，为造血系统发育研究提供了全新的思路，实验体系和海量的数据支撑。安秀丽教授现为世界范围内红系研究领域的领军人物之一，在Cell、Cell Stem Cell、PNAS、Blood等权威学术期刊发表论文130余篇，其中9篇论文被列为当期推荐文章，总被引频次逾6000次。曾多次受邀在Gordon Conference、ASH等重要学术会议作专题报告。以大会主席身份三次主持召开了“国际红细胞生物学研讨会”。任美国血液学红细胞分委会委员、中国生理学会血液专业委员会副主任委员、以及JBC等20多种生物学领域重要期刊同行审稿专家，曾任血液学权威期刊Blood编委。
专家点评
王文（西北大学）
基因型-表型映射关系的演化是进化生物学关注的焦点之一。1975年，King和Wilson的经典著作比较了人和黑猩猩约100个同源蛋白的序列，发现差别很小，甚至没有差别，从而提出人和黑猩猩的表型差异，主要由调控蛋白如何表达的调控序列的演化来驱动。该文发表30年后，Carroll专文纪念这个经典工作时称其有三方面的意义，即通过大规模比较创立了进化基因组学，从分子到表型引领了进化发育生物学，同时吹响了探索人类特异性状之遗传基础的号角。
很巧合，余佳/张勇/石莉红等联合团队这一工作也同时在这三个方向有其意义。首先，该工作比较了两类假基因之后发现DNA水平重复来源的假基因倾向于通过RNA结合蛋白发挥作用，而逆转录重复来源的假基因倾向于结合miRNA发挥作用。这种功能演化模式的不同很可能是由它们起源突变机制的不同所贡献，即逆转录常以polyA尾为引物启动因而保留了祖先拷贝的3’端miRNA结合位点而DNA水平的重复假基因经常丢失3’端导致无法发挥类似功能。这是进化基因组学领域崭新的将突变机制与重复拷贝未来演化命运相关联的工作，说明突变过程并非像传统想象的那样只是被动提供变异。其次，已有的大量进化发育生物学研究工作揭示了发育过程的可演化性（evolvability）。但这些工作多围绕蛋白编码基因或其顺式调控序列的进化展开。除了我和合作者发现的推动果蝇中求偶行为演化的逆转录假基因Sphinx外，假基因或其它非编码基因在发育进化乃至表型演化中的角色少有探讨。该工作对DNA重复假基因HBBP1的功能研究显示该基因参与人类正常乃至病理条件下的红细胞发育。有意思的是这个假基因在大多数哺乳动物不表达，缺乏选择压力，确实像演化中的基因残骸；然而在人类祖先与黑猩猩分歧之后，该基因再次复活，在红细胞发育中扮演重要角色。HBBP1与此前若干基于物种特异性蛋白编码新基因的研究类似，说明了核心发育网络的快速演化能力。最后，人类演化研究多聚焦于高度发达的脑等众所周知的人类特异性表型。HBBP1这个例子的发现暗示着我们作为一个物种，拥有很多与其他哺乳动物不同的、不是那么显而易见的特异发育程序。这意味着人类生物学研究乃至医学研究需要更多地将模式动物、人类大量的个体变异、人类类器官模型等多系统结合，才能更好地理解我们自身的生理学奥秘。
整体来看，该研究整合进化基因组学、进化发育生物学和分子生物学手段，通过假基因这一独特视角，围绕着基因型-表型映射关系这一基础问题所带来的一系列发现有其概念创新性，是值得一读的佳作。
专家简介
王文，教授，西北工业大学生态环境学院教授，中国科学院动物进化与遗传前沿交叉卓越创新中心客座研究员。《Science China Life Science中国科学.生命科学》、《Current Zoology》、《Zoological Research》、《生物多样性》编委。
王文教授长期从事进化基因组学研究，是基金委杰出青年基金获得者，基金委创新研究群体负责人，国家重大科学研究计划（973）首席科学家，科学战略性先导专项（B）首席科学家，“百千万人才工程”国家级人选，一项“国家自然科学二等奖”第一完成人。
多年来，其研究团队一直活跃在进化基因组学研究前沿，在微进化和宏进化两个尺度上利用基因组学大数据解析生物适应进化的遗传机制，取得了一系列原创性成果。以第一或通讯作者（含共同）在《Science》（5篇）、《Nature Genetics》、《Nature Biotechnology》（4篇）、《Nature Ecology and Evolution》（2篇）、《Nature Communications》（6篇）、《PNAS》等重要学术刊物上发表多篇论文。目前论文被引用1万5千多次，H index为55。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.12.019
参考文献
1. Cheetham, S.W., et al. (2020). Overcoming challenges and dogmas to understand the functions of pseudogenes. Nat Rev Genet 21, 191-201.
2. Li, W., et al. (2013). Pseudogenes: pseudo or real functional elements? Journal of genetics and genomics40, 171-177.
3. Dennis, M.Y., and Eichler, E.E. (2016). Human adaptation and evolution by segmental duplication. Current opinion in genetics & development41, 44-52.
4. Zhang, Y.E., and Long, M. (2014). New genes contribute to genetic and phenotypic novelties in human evolution. Curr Opin Genet Dev29, 90-96.
5. Chang LY, Slightom JL. (1984). Isolation and nucleotide sequence analysis of the beta-type globin pseudogene from human, gorilla and chimpanzee.J Mol Biol. 180, 767-784.
6. Giannopoulou, E., et al. (2012). A single nucleotide polymorphism in the HBBP1 gene in the human beta-globin locus is associated with a mild beta-thalassemia disease phenotype. Hemoglobin36, 433-445.
7. Nuinoon, M., et al. (2010). A genome-wide association identified the common genetic variants influence disease severity in beta0-thalassemia/hemoglobin E. Hum Genet127, 303-314.
8. Huang, P., et al. (2017). Comparative analysis of three-dimensional chromosomal architecture identifies a novel fetal hemoglobin regulatory element. Genes Dev 31, 1704-1713.
9. Xu, J., et al. (2011). Correction of sickle cell disease in adult mice by interference with fetal hemoglobin silencing. Science334, 993-996.