水务看点｜发光细菌在线监测水体污染将向更稳定、更高灵敏度、更低检出限发展

导读

发光细菌法作为在线生物毒性监测方法之一，被广泛应用在水污染监测中，也是商品化应用最好的生物毒性技术。未来的发光细菌法如何发展？未来的生物毒性监测技术将会随着发光细菌法的发展发生什么样的变化？读完这篇文章，或许您会有所思考。

发光细菌作为可以进行生物发光的细菌，它的出现总是给人带来神秘。漫步在海滩，当你看到沙滩上泛起的蓝色荧光时，你感受到的是它的无限美丽与美好。其实，这些“蓝色荧光”已经悄悄地在告诉你，这里的水质情况，而你却不自知。这些“蓝色荧光”拥有统一的名字，即发光细菌。

图片来源于网络

１发光细菌监测水质生物毒性的原理

水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光强度与水样中毒性组分总浓度呈负相关关系，通过生物发光光度计测定水样与发光细菌接触15min后的发光抑制率来表征水样的急性毒性水平。发光细菌的生物发光反应是由于分子氧作用，细胞内荧光酶催化将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化为黄素单核苷酸及长链脂肪酸，并释放出最大发光强度在490nm处的蓝绿光。生物毒性的表征指标为相对发光强度或抑光率，相对发光强度是测试样本发光值（样品管发光值）与控制样本发光值（对照管发光值）对比后所得，结果以百分比表示。抑光率一般为正值，有时候抑光率会呈现负值，此时说明水中存在使发光菌菌数增加的有机物，即可同化有机物(AOC)及可生物氧化有机物(BDOC)。

２发光细菌监测水质生物毒性结果的评价

国家海洋局《污水生物毒性监测技术规程 发光细菌急性毒性测试－费歇尔弧菌法》提到，样品毒性水平的表征方法采用检测结果中的15min发光抑制率Ｈ进行评价。根据Ｈ大小将毒性等级分为３级，相应等级分别为低度毒性风险、中度毒性风险、高度毒性风险，分级方法如表１所示。中科院土壤研究所制订的水质毒性分级标准中，根据相对发光率的大小将毒性等级分为低毒、中毒、重毒、高毒、剧毒５个等级，如表２所示。

表１污水样品毒性风险等级评价方法

表２水质急性毒性分级标准

３发光细菌监测水质生物毒性的标准

目前，市面上应用最广泛的发光细菌有３种：明亮发光杆菌、费氏弧菌、青海弧菌，如图１所示。其中，明亮发光杆菌和费氏弧菌为海洋菌，青海弧菌为我国发现的淡水菌。ZnSO－4·7H₂O对３种菌种的EC50（单一化学物质使抑光率达到50%时该物质的浓度）最小的为费氏弧菌，费氏弧菌的灵敏度更高。

（a）明亮发光杆菌；（b）费氏弧菌；（c）青海弧菌

图1  3种发光细菌类型

表３列出了明亮发光杆菌(P.phosphoreum)以及费氏弧菌(Vibriofischeri)等所涉的国内外标准。ISO11348的３个标准，主要区别在于费氏弧菌的状态不同：第１标准采用的是新鲜制备的费氏弧菌；第２标准采用的是液体干细菌；第３标准采用是冻干粉细菌。其中，ISO11348-3-2017是应用最广泛的国际标准。涉及青海弧菌的暂时没有标准，仅在《水和废水监测分析方法》第四版书籍中提到。

ISO11348-3-2017与GB15441—1995相比，主要有以下两点区别。（１）利用的发光菌不同，且保存菌种的温度不同，前者用的是费氏弧菌，保存温度为-20℃；后者为明亮发光细菌，保存温度为２～５℃；因此，对于需要长期保存的冻干粉而言，冷冻温度越低越好。（２）前者要求测定加入水样前发光细菌的原始荧光强度，并根据对照试样做出校正，避免了细菌样品不均匀带来的误差影响。

表３发光细菌监测水质生物毒性的标准

４发光细菌在线生物毒性监测仪的研究现状

4.1菌种制备技术发展

菌种技术的发展重点在于发光细菌冻干制剂制备技术。菌种的冻干制品直接由冰晶升华制成，具有多孔结构，既能使细菌保持原有活性，又不会破环细胞的形态以及特性。冷冻干燥是将细菌悬浮液冷冻到冰点以下，从而转变为固体结晶态，然后在低温低压（真空）下使固体升华而脱水的干燥方法。与新鲜菌液相比，菌种制成冻干制品后可以长期保存，简化了发光细菌法的前期工作。杨毅红等发明了一种海洋发光细菌冻干制剂（明亮杆菌）及其制备方法，属于微生物冻干制剂范畴。该冻干制剂包含菌泥和冻干保护剂，且经菌液制备、菌泥制备、混合、预冻和冻干等步骤制备而成。该保护剂制得的海洋发光细菌冻干粉于２～８℃下保存18个月后，菌种恢复发光率及菌种发光性能均维持稳定，能极大地提高海洋发光细菌菌种的保存效果和质量，便于环境毒性检测中对菌种的使用。

4.2菌种在线活化技术运用

商品化的生物在线监测仪一般维护周期为２周。发光细菌冻干粉复苏后的有效期一般不超过10d，聚光科技和希思迪联合开发的T3000运用了仪器菌种自动保存和在线活化技术，将维护周期延长到28d。赵东红发明了一种水质生物毒性在线检测的装置，包括制样单元（水样预处理单元）、机械手单元、取样检测单元及驱动分析单元，且制样单元和取样检测单元均采用平行双通道的技术方案，可实现参比水样和待测水样的同时测定，消除了系统误差和测量偏差，设计了菌液储存池和菌液复苏池，通过在线活化技术实现维护周期的延长。Bodini等研究了一种新型的细菌管理装置，其由１个开瓶器和１个装有冻干细菌的３个小瓶的冷藏室组成。整个过程编程自动运行，包括打开小瓶、添加22mL的缓冲液复苏细菌、丢弃耗尽的细菌等操作。

4.3平行双通道技术的应用

2010年，聚光科技TX2000采用的是单通道技术，蠕动泵将空白对照液和待测样品按顺序泵入流路，同时，蠕动泵也将缓冲液和菌液泵入流路，三者混合在混合环，混匀反应一定时间后到达光电检测装置。此时，软件控制光电检测装置获取有用的光信号，分别得到参比光度值和样品的光度值。为了保证系统误差和测量误差的消除，运用平行双通道可以实现参比水样和待测样品的同时测定。平行双通道技术的运用也增加了仪器成本，主要是参比反应池和样品反应池独立分开、测试管路两路、光电检测器的增加等。

4.4信息化技术

传统的在线监测仪器，其基础的信息处理技术为设备驱动、实时监控、数据管理、远程预警，但这已经不能满足水质管理的要求，因此，通过信息化技术实现数据更高层次的利用是未来发展的方向。黄静发明了一种在线生物毒性监测仪，对待测试水样进行测试，得到水样的水样测试反应过程曲线以及抑制率。利用毒性物质毒性分级清单确定抑制率对应的毒性等级，利用曲线相似性算法对水样测试反应过程曲线进行曲线形状相似性识别，依据抑制率从标准毒性物质的反应过程测试曲线数据库中识别相似度最高的反应过程测试曲线，并将其对应的毒性物质信息作为待测试水样的毒性物质信息。该方法实现了对水质毒性信息的分级分类，解决了现有技术中无法对水质中毒性物质量化的问题，且通过曲线形状相似性识别提高了分级分类的准确性。

4.5移动式监测技术应用

现有的在线生物毒性监测仪基本都是安装在固定的自动监测站点来实现各类水质的在线监测，仪器体积大，不适合野外自动运行。汤冬云等发明了一种水质综合生物毒性在线监测自动分析仪器，设置有独特的光电检测单元，集成度高、结构小巧、便于移动，适用于野外测试，同时自动化程度高，能够在线实时监测，无需人工值守，且检测灵敏度高、准确度好。

4.6联合技术应用

现有的技术中，进行生物毒性监测时，通常只使用单一生物传感器，但不同的生物传感器对不同污染物的反应是不同的。例如，发光菌对金属比较敏感，而对有机物不太敏感，鱼类则相反，利用单一生物的反应来判断水体污染的情况，无法做到全面了解水污染的状况。因此，桂子荣等设计了一种基于鱼类和发光菌的在线生物毒性监测仪，利用双光路监测模块同时监测水样池和参比池的微生物荧光信号，并将荧光信号转换成电信号传递至控制单元分析；利用行为监测器对试验鱼类的行为进行跟踪拍摄，根据鱼类群体活跃程度、鱼群离散程度等群体参数变化对水体污染情况进行监测。

５ 总结与展望

国家对水环境质量监测越来越重视，基于发光细菌法的在线生物毒性监测方法从“十二五规划”开始到“十三五”也取得了很好的进展。随着生活水平的提高，现代社会对饮用水的水质要求也越来越高（从“合格水”转变为“优质水”）。

（１）发光细菌毒性生物监测方法在水环境中有广泛的应用，发光细菌菌种技术未来发展的方向：更稳定、更高灵敏度发光菌种的研究；菌种的冻干制备技术的进一步发展。

（２）发光细菌在线生物毒性监测仪的发展方向：针对饮用水低毒的特点，发光细菌在线生物毒性监测仪应向更低检出限发展；针对废水水体的复杂性，在线生物毒性监测仪水样分析预处理技术是研究的主要方向；多物种同时监测可以更好地提升数据的可信度和精密度，将发光细菌生物监测仪作为基础，与其他物种监测仪共同开发联合技术将是发展的一个方向。随着其他生物传感器（斑马鱼）等标准的实行，未来在线生物毒性监测仪的种类将更加丰富，监测方式也将更加立体。

拓展阅读

王颖,廖訚彧,欧阳莎莉,等. 发光细菌在线监测水体污染研究进展[J]. 净水技术, 2020, 39(9):10-16.

WANG Y, LIAO Y Y,OUYANG S L, et al. Research progress of on-line monitoring technology of water pollution by using luminescent bacteria[J]. Water Purification Technology, 2020, 39(9):10-16.

作者：王颖,廖訚彧,欧阳莎莉,等。