生物分析专栏 | 抗体鸡尾酒疗法的研发和生物分析

抗体鸡尾酒疗法（antibody cocktail）是有别于传统抗体组合联用的一种新形式，是通过不同的比例和组合把不同的抗体混合为一个药物，弥补单一抗体作用的不足，实现“1+1>2”的药效作用。

虽然抗体鸡尾酒疗法和抗体组合联用有很多共通之处，但仍存在许多不同。其中最显著的区别在生产制造环节，抗体组合是分别生产上市，临床上联合使用；抗体鸡尾酒是在制造环节就将抗体混合在一起，组成单一制剂包装。另一个区别就是在抗体的设计上，抗体组合联用的开发阶段都是将单一抗体作为药物单独开发后申报上市，上市后再联合使用，在开发设计阶段更多关注抗体自身的疗效和安全性，而抗体鸡尾酒设计的初衷就是为了联合不同抗体的优势，开发设计阶段更多关注抗体之间的相互作用和功能互补。当然如果联合作用机制明确，抗体在临床联合使用也可以转为开发成抗体鸡尾酒疗法，最成功的案例就是Roche的Perjeta和Herceptin，目前两个抗体均已获批，并在临床上联合使用，Roche进一步开发了固定剂量组合抗体鸡尾酒制剂配方，目前该鸡尾酒疗法已经提交上市申请。

抗体鸡尾酒疗法研发现状
抗体制药能够快速发展成为生物制药的龙头，得益于单克隆抗体技术的发展。单克隆抗体克服了诸多多抗的弊端，单抗药物的市场规模远超多抗。开发抗体鸡尾酒疗法既发挥了单抗的组分明确、质量可控、副作用低等优点，又兼顾了多抗结合位点多、亲合力强、逃逸可能性低等优点，有效利用单抗和多抗各自的优势，充分发挥不同抗体的功效，能够成为抗体制药的有利补充。
表1 单抗 vs 多抗 vs 抗体鸡尾酒属性比对
2019年9月印度药监局批准了狂犬抗体鸡尾酒疗法药物RabiMabs的上市申请，开辟了抗体鸡尾酒疗法的新局面。但欧美主流市场目前还没有抗体鸡尾酒疗法获批的产品，多种抗体鸡尾酒疗法已经在不同疾病中得到应用，欧美市场进展较快的品种已经处于临床试验晚期或上市申请阶段。2020年2月25日Roche提交了Perjeta与Herceptin固定剂量组合（FDC）皮下制剂上市申请，还有Regeneron公司的Ebola抗体鸡尾酒组合REGN-EB3，FDA已经在4月16日接受其BLA申请并授予优先评审资格。
图1 目前在研抗体鸡尾酒疗法[1]
抗体鸡尾酒疗法主要应用领域
目前抗体鸡尾酒疗法研究主要集中在抗感染和肿瘤领域，之所以在这两个领域研究较多，是因为这两个领域能最大程度的发挥鸡尾酒疗法的优势。
1． 抗感染领域
抗感染领域的药物很多，产品迭代也较快，产品研发面临的两个主要问题是广谱性和耐药性。以狂犬病毒为例，不同来源的狂犬病毒毒株的序列有所差异，一种单克隆抗体难以对全部的毒株并起到保护作用。由于狂犬病毒是100%致死性病毒，给予的单抗若不能中和病毒就意味着患者死亡，这一点大大限制了单抗的使用和开发。抗体鸡尾酒疗法由结合不同抗原表位的抗体组成，最大程度的覆盖全部毒株，极大地降低了不同毒株感染带来的风险。
图2 狂犬病毒基因进化树[2]
除了天然的感染类病原体不同亚型（毒株）序列的不同，导致抗体保护效力存在差异，抗感染抗体开发的另一个难点是逃逸（耐药）。由于感染类病原体的复制周期短，突变频率高，药物在使用过程中经常会面临耐药的问题。而此时如果使用鸡尾酒疗法，不同抗体针对的抗原表位不同，当其中一种抗体发生耐药时，其他抗体依然能够起到保护作用。
图3 狂犬抗体结合表位图[3]
本次新冠疫情的药物研发，除了大家最关注的疫苗外，中和抗体是另一类药物研发的重点。2020年6月1日，Eli Lilly公司与AbCellera合作开发的新冠病毒中和抗体LY-CoV555进入临床研究，是全球第一进入临床研究阶段的新冠病毒中和抗体药物。国内，君实生物于2020年6月7日宣布其新冠病毒中和抗体JS016进入临床研究阶段。Eli Lilly和君实生物的新冠病毒中和抗体均来源于康复患者外周血分离的单个B细胞。考虑到新冠病毒已经发生突变及抗体临床使用潜在的逃逸风险，中国疾控中心、军科院等研究团队均将抗体鸡尾酒疗法放在了新冠病毒中和抗体药物研发的首位。Regeneron公司利用其独有的VelocImmune平台结合康复患者外周血分离的单个B细胞分离技术，开发了两款中和活性高，且无竞争的新冠病毒抗体，组成抗体鸡尾酒REGN-COV2，对目前已知的突变毒株具有中和作用，该抗体鸡尾酒已于2020年6月11日进入临床研究阶段。
图4 抗体鸡尾酒对新冠突变逃逸毒株有保护作用[4]
2． 肿瘤领域
肿瘤领域的抗体几乎已经占据抗体药物的半壁江山，以Keytruda，Opdivo，Avastin，Rituxan，Herceptin为代表的抗肿瘤抗体药物已经成为抗肿瘤药物中最畅销的品种。Keytruda在2019年的销售更是首次突破百亿美元。尽管作用机制明确，毒性可控，但抗肿瘤单克隆抗体离完全攻克癌症依然很远，肿瘤对抗体的耐受主要是由于肿瘤的异质性和适应性引起的。抗体鸡尾酒疗法在肿瘤中的应用可以克服肿瘤的异质性和适应性。目前，大部分抗体公司还是以单抗开发为主，在单抗的疗效得到初步临床验证后，才会考虑单抗联合和抗体鸡尾酒疗法，而绝大多数抗体公司手中并没有Roche这样顶级公司丰富的产品线，因此限制了抗体鸡尾酒疗法的开发。以Symphogen为代表的一批致力于抗体鸡尾酒研发的创新型公司，从项目立项之初就着眼于抗体鸡尾酒疗法，这或许是me better抗体药物研发的另一种思路。

视频：抗体鸡尾酒在克服肿瘤异质性和适应性方面的优势

抗体鸡尾酒疗法研发关注点
抗体鸡尾酒疗法研发初衷是联合不同的抗体协同进行疾病治疗，所以抗体鸡尾酒疗法中各种组合的抗体不能存在相互抑制干扰。Roche的Pertuzumab和Trastuzumab就是一对互不干扰的抗体组合，虽然两个抗体都结合HER2抗原，但两者的结合表位不同，没有竞争关系，两者在体内互不影响。
图5 Pertuzumab和Trastuzumab结合表位示意图[5]
图6 Pertuzumab药代曲线w/wo trastuzumab[6]
如果组成鸡尾酒疗法的抗体具有不同的代谢性质或者抗体的毒性反应差别较大，则需调整给药方式和剂量、优化抗体配伍比例、优化制剂配方组成等，以平衡不同抗体在体内的代谢并降低毒性。
图7 抗体鸡尾酒制剂配方[1]
生物分析方法
准确可靠的生物分析方法对抗体鸡尾酒疗法的研发至关重要。抗体鸡尾酒疗法中的抗体可能针对的是同一抗原，仅在结合表位上有所区别，因而传统的基于抗原结合的间接免疫法并不适用。为了区别针对同一抗原不同表位的组合抗体，需要使用抗独特型（anti-idiotype）抗体。抗独特型抗体是针对抗体可变区的抗原决定簇（独特型）产生的特异性抗体，能够直接识别、结合抗体可变区，能够特异性的区别针对同一抗原的不同抗体，是鸡尾酒疗法生物分析中不可或缺的关键试剂。
图8 抗独特型抗体结合位点示意图[7]
REGN-EB3为3个抗Ebola单克隆抗体鸡尾酒疗法，3个抗体均靶向病毒糖蛋白。通过抗独特型抗体的使用，能够实现对单一抗体的检测。
图9 REGN-EB3与Ebola病毒糖蛋白结合结构示意图[8]
图10 REGN-EB3各组成抗体药代曲线[9]
基于抗独特型抗体的免疫分析方法是抗体鸡尾酒分析的首选。当抗独特型抗体不可获得时，LC-MS/MS方法则是有利的补充方法。LC-MS/MS方法越来越多的被应用和接受，质谱对于特征片段的鉴定完美匹配了鸡尾酒疗法对单一抗体进行区分的要求。
Perjeta和Herceptin固定组合制剂（FDC）是目前研究最为成熟的抗体组合，两个抗体的靶点都是HER2抗原，利用LC-MS/MS方法可以实现同时检测这两个抗体，并且两者检测互不干扰。
图11 Trastuzumab色谱图(RT=2.67) [10]
图12 Pertuzumab色谱图(RT=2.95)[10]
图13 Infliximab(IS)色谱图(RT=2.84) [10]
表1 LC-MS/MS同时检测血清中Perjeta和Herceptin
结语
随着对疾病治疗更优方案的需求增加，单抗药物的组合使用几乎成为抗体研发进程中的一个重要阶段，也将有更多的抗体鸡尾酒疗法被应用到临床。2020年下半年欧美市场即将迎来抗体鸡尾酒疗法的首次批准，预计会大大刺激抗体市场，带起一波抗体鸡尾酒研发热潮。生物分析对于了解抗体鸡尾酒的不同抗体的代谢属性，研究抗体-抗体相互作用，指导抗体鸡尾酒制剂配伍具有重要作用。伴随着抗体鸡尾酒疗法的兴起，其生物分析方法也将成为药企和监管机构关注的重点。

参考文献

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[15]https://investor.lilly.com/news-releases/news-release-details/lilly-begins-worlds-first-study-potential-covid-19-antibody

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