慢病毒包装实验步骤及注意事项

当下，基因编辑技术越来越火热，带动慢病毒包装实验越发普遍，但是大家通常在潜意识会觉得病毒载体包装过程太复杂而不敢尝试，确实，除去实验过程本身繁杂之外，做慢病毒包装实还经常容易出现各种状况，比如稳定性很差、滴度低，或者就是根本不出毒等等。

　　但是，热点可不等人，该来的迟早还是会来的，下面小编就为大家详细介绍一下慢病毒包装实验的基本步骤以及注意事项，希望大家能自己学会，掌握“核心”技术!

　　慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒。慢病毒在感染细胞时，首先会将宿主RNA逆转录为DNA，并将逆转录基因插入到宿主基因中表达。慢病毒的基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具。

　　以最常做的质粒共转染293T细胞为例，为了得到高滴度的慢病毒，慢病毒包装方法是利用表达载体与包装质粒共同转染细胞，在细胞中进行包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。

　　实验流程示意

　　实验材料

　　1)含有目的基因的病毒载体：一个包装质粒混合物(Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2)和一个慢病毒载体质粒(LentiviralVector)组成;

　　2)指数生长的293T细胞;(培养条件：DMEM+10%PBS，37℃，5%CO2)

　　3) 试剂：胎牛血清、Opti-MEM、转染试剂

　　实验步骤

　　第一步：细胞分盘

　　转染前一天,通过胰消化传代于35mm培养皿上,使细胞贴壁后所古面积达到培养皿总面积的80%以上)。将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。

　　第二步：病毒转染

　　1) 转染前1h换液(用1.5mL完全培养基换掉旧的培养基)。
　　2) 制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物：取无菌1.5mL EP管，加入400µl 无血清Opti-MEM，加入1.5µg 核心质粒和1.5µg 病毒包装质粒，及6µl 转染试剂 (转染试剂 ：质粒=2:1)，充分混匀，静置15-20min。
　　3)取出培养皿,将配置好的DNA-转染试剂混合物加入到培养皿中,轻轻混匀,做好标记,放回培养箱中。
　　4)6~8h后吸去培养基,用4 mL PBS清洗一次后,加入8mL新鲜完全培养基培养。

　　第三步：收集病毒

　　转染后每隔24小时收集培养后的上清至50mL离心管,做好标记,并给细胞更换新鲜的完全培养基，

　　实验注意事项

　　(1)包装后收集到的病毒可以进行病毒浓缩，收集高纯度的病毒样品。同时可以进行病毒梯度测定，根据病毒浓度选取最佳的病毒侵染浓度。

　　(2)包装病毒时应该选用生物安全柜进行操作，做好防护工作。病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套，使用过安全柜后，先新洁尔灭擦拭台面，再用75%酒精擦拭。另外，使用后的枪头、器皿、废液等进行高压灭菌灭活。

　　怎么样，简简单单三步，实验就完成了，看起来是不是很简单！但是，虽然看起来简单，其实每一个步骤是非常复杂的，周期也很长，为了保证其结果的正确性，大家动手的时候还需要非常注重自己的操作细节才行，想要掌握“核心“技术，还要靠不断的积累和学习。