新冠疫情席卷全球，感染人数节节攀升，疫苗研究迫在眉睫。11月16日，美国药企Moderna宣布，根据对包含3万名受试者的大型三期临床试验的中期分析，其新冠肺炎疫苗有效性超94%。而仅仅一周前，美国辉瑞制药和德国BioNTech联合宣布，双方合作新冠疫苗的三期临床试验首次中期分析显示其有效性达90%以上。两种mRNA疫苗有效性远超预期，有望迅速缓解全球新冠疫情的带来的危机。由此，mRNA疫苗进入了大家的视野。什么是mRNA疫苗？mRNA疫苗相较于其他的疫苗又有何优势？这些问题引发了大家的关注。疫苗为何如此牵动人心？每年各式各样的疫苗每年预防数百万疾病、拯救无数生命。由于广泛使用疫苗，天花病毒已被彻底根除，小儿麻痹症、麻疹和其他儿童疾病的发病率在世界各地大大减少1。尽管疫苗学在预防各种疾病中功勋卓著，但针对各种感染性病原体的疫苗开发仍存在重大障碍，特别是那些能够更好地逃避适应性免疫应答的病原体。而且，针对目前出现的新型冠状病毒（SARS-CoV-2），想要研发新的病毒疫苗主要障碍不是传统方法的有效性，而是需要更迅速的开发和大规模部署。最后，传统的疫苗方法也不太适用于癌症等非传染性疾病。因此，迫切需要开发更有效、更多功能的疫苗平台。与这种巨大的需求和呼声中，mRNA疫苗应运而生成为传统疫苗方法的有希望的替代品。1990年，科学家首次报道了体外转录mRNA注射到的动物体内后可以在动物体内检测到蛋白质的产生2（图2）。随后的1992年科学家们证明，在大鼠的下丘脑中使用抗利尿激素（Vasopressin）编码mRNA可以引起生理反应3，再次给出了稳健的、可信的数据证明了mRNA作为疫苗注射到体内产生蛋白质的巨大潜力。但是，由于在进行mRNA疗法的研究过程中，大家对于mRNA稳定性、先天免疫原性、体内传递效率等方面的担忧，mRNA疫苗的研究一度落后于以DNA和蛋白质为基础的治疗手段的研究之后。图1 1992年首次证明mRNA注射后产生蛋白质的文章3在过去的十年中，重大的技术创新和研究投资使mRNA成为疫苗开发和蛋白质替代治疗领域的一种有前途的治疗工具。相对于灭活和减毒活病毒以及基于DNA的疫苗，mRNA的使用有几个有益的特点。第一，mRNA疫苗的安全性更高。由于mRNA是非感染性、非整合的平台，不存在感染或插入突变的潜在风险。另外，mRNA可以通过正常的细胞过程降解，其体内半衰期可以通过使用各种修饰和传递方法来调节。mRNA的固有免疫原性可以下调以进一步提高安全性4。第二，mRNA疫苗的mRNA功效更上一层楼。各种修饰使mRNA更加稳定和高度可译，有效的体内传递可以通过将mRNA合成为载体分子来实现，允许在细胞质中快速摄取和表达5。mRNA为最小遗传载体，避免了抗媒介免疫，可用于mRNA疫苗的反复接种。第三，mRNA疫苗可用于大规模生产。由于体外转录反应的高产量，mRNA疫苗具有快速、廉价和可扩展的生产潜力。mRNA是蛋白质编码DNA的翻译和细胞质中核糖体产生蛋白质之间的中间步骤。目前作为疫苗研究的RNA主要有两种：非复制mRNA和病毒来源的自扩增（Self-amplifying）RNA。传统mRNA-based编码抗原和疫苗包含5ʹ和3ʹ未翻译区（Untranslated regions，UTRs），而自扩增RNA编码不仅抗原还同时包含病毒复制元件，使细胞内RNA扩增并达到丰富的蛋白表达的目的。最适合于治疗用途的是IVT mRNA。简单地说，IVT mRNA由T7、T3或Sp6噬菌体RNA聚合体的线性DNA模板生成7。由此产生的产品优化应该包含一个开放阅读框编码感兴趣的蛋白质、侧翼的UTRs、5’帽子和poly（A）的尾巴。因此，mRNA被设计成类似于真核细胞细胞质中自然发生的经过充分处理的成熟mRNA分子。复杂的mRNA在体内的传递也是前期需要进行的mRNA疫苗的基础研究。裸露的mRNA被细胞外会被RNases快速降解并不能有效地内在化。因此，需要开发出各种各样的体外和体内转染试剂，以促进细胞对mRNA的摄取并保护其免受降解。一旦mRNA转到胞浆中，细胞翻译机制就会产生经过翻译后修饰的蛋白质，从而形成正确折叠的、功能完整的蛋白质。mRNA药理学的这一特性对于疫苗和蛋白质替代疗法尤其有利，因为这些疗法需要细胞质或跨膜蛋白被运送到正确的细胞隔室中以实现适当的呈现或功能。IVT mRNA最终通过正常生理过程降解，从而降低代谢物毒性的风险。几代科学人的努力将mRNA疫苗在临床和预防治疗方面的应用大大的推进，成为目前新冠病毒疫苗研究的大热平台之一。近些年来，mRNA疫苗的研究逐步优化，在mRNA翻译和稳定性方面、免疫原性调节方面、mRNA疫苗传递方面的研究（图3）都取得了巨大的进展，仅是mRNA疫苗的递送方式方面就已有超过12种之多（图3），极大地拓展了关于mRNA疫苗的应用8。研制针对传染性病原体的预防性或治疗性疫苗是控制和预防流行病的最有效手段。然而，传统的疫苗方法在很大程度上未能产生有效的疫苗来对抗引起慢性或反复感染的具有挑战性的病毒，如HIV-1、单纯疱疹病毒和呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）。此外，商业疫苗开发和批准的步伐缓慢，不足以应对急性病毒性疾病的迅速出现，2014年2016年爆发的埃博拉和寨卡病毒就是例证。因此，开发更有效、更多功能的疫苗平台至关重要。为了解决寨卡病毒大流行带来的危害，2017年关于寨卡病毒的mRNA疫苗发表在了Nature上，文章题为Zika virus protection by a single low-dose nucleoside-modified mRNA vaccination，介绍了mRNA疫苗作为一种多用途和高效的平台来传递疫苗抗原和治疗蛋白的方法。在该工作中作者们证明了使用编码2013年ZIKV病毒爆发菌株的膜前和包膜糖蛋白的脂纳米颗粒封装核苷化mRNA进行单次低剂量皮内免疫，在小鼠和非人灵长类动物中引发了有效和持久的中和抗体反应。在免疫接种后2周或5个月，用核苷化的寨卡病毒核苷化mRNA进行免疫接种，可以保护小鼠免受寨卡病毒的威胁，在非人灵长类动物中也可以达到免疫保护的作用。这些数据表明，核苷修饰的mRNA可产生快速而持久的保护性免疫，因此为全球抗击寨卡病毒以及相关疫苗的研制提供了一种新的、有前景的候选方案。除此之外，新冠疫情的肆虐影响全球的公共卫生安全。2020年7月，Nature发文题为SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness，介绍了关于原型病原体准备的SARS-CoV-2 mRNA疫苗设计方案10。关于SARS-CoV-2结构方面的研究可以在刺突蛋白（Spike）中引入突变使得刺突蛋白可以稳定在预融合状态（Prefusion state），提高表达量并增加免疫原性。这一原理已被应用于设计mRNA-1273，这是一种编码在预融合构象中稳定的SARS-CoV-2 刺突蛋白的mRNA疫苗。mRNA-1273诱导对野生型和突变型SARS-CoV-2以及CD8+ T细胞的有效中和抗体反应并保护小鼠肺部和鼻子免受SARS-CoV-2感染。mRNA-1273目前正在进行三期试验，以评估其疗效。Moderna公司宣布了对mRNA-1273新冠疫苗的临床前研究的评估，表明在非人灵长类动物的上呼吸道和下呼吸道中，mRNA-1273的两剂疫苗接种方案可产生强大的免疫反应和针对新冠病毒感染的保护作用。现今，全球对该mRNA疫苗的期待值很高，初步的数据也证明了其高效性。Moderna公司在研新冠疫苗与此前宣称有效率超过90%的辉瑞疫苗同属于mRNA疫苗，福奇博士对mRNA-1273在临床方面的应用持乐观态度。图6 mRNA-1273疫苗的安全性与免疫原性评估11新冠病毒疫苗的研究设计到全球的健康和公共卫生安全问题，mRNA疫苗在此过程中发挥了巨大的作用。作为全球科学服务的领导者，Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技）可提供一系列的高质量产品用于mRNA疫苗的研究及生产，覆盖mRNA生产、纯化及递送整个流程。在mRNA疫苗生产阶段，赛默飞提供满足不同要求的体外转录试剂盒，例如mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA Transcription Kit可合成加帽加尾的RNA，含有专利的ARCA帽子，具有更高的活性；mMESSAGE mMACHINE™ T7 Transcription Kit可高产量的合成加帽RNA；MEGAscript™ T7 Transcription Kit则纯粹合成RNA单链，不加头或尾，使用者可根据自己的需求进行加帽、加尾。图7 mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA Transcription Kit除此之外，赛默飞还可提供专用于mRNA疗法的TheraPure试剂，其具有超高纯度且不含动物源成分，适用于工业级规模化生产。TheraPure产品线可为mRNA合成提供独特的完整解决方案，覆盖体外转录、转录后修饰及模板降解等流程。在mRNA纯化阶段，赛默飞可提供MEGAclear™ Transcription Clean-Up Kit用于快速有效地从游离核苷酸、酶和缓冲液组分中分离高纯度RNA，适用于小规模纯化；基于Invitrogen Dynabeads MyOne Carboxylic acid 和特有结合缓冲液的纯化方法可实现更高的mRNA回收率，更适合用于大规模纯化。在mRNA递送阶段，赛默飞的Lipofectamine MessengerMAX就是一种专用于mRNA递送的转染试剂，值得注意的是，该试剂特别适用于神经元和原代细胞的转染，具有惊人的转染效率。Invivofectamine 3.0试剂是一种突破性的体内RNA输送试剂，可大幅改善实验性能，使用微克级的RNA即可达到出色的实验效果，操作简单，体内毒性极低。图9 Lipofectamine MessengerMAX【1】World Health Organization. Immunization coverage. World Health Organization http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs378/en (2017).1Younger, D. S., Younger, A. P. & Guttmacher, S. Childhood Vaccination: Implications for Global and Domestic Public Health. Neurologic clinics 34, 1035-1047, doi:10.1016/j.ncl.2016.05.004 (2016).2Wolff, J. A. et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science (New York, N.Y.) 247, 1465-1468, doi:10.1126/science.1690918 (1990).3Jirikowski, G. F., Sanna, P. P., Maciejewski-Lenoir, D. & Bloom, F. E. Reversal of diabetes insipidus in Brattleboro rats: intrahypothalamic injection of vasopressin mRNA. Science (New York, N.Y.) 255, 996-998, doi:10.1126/science.1546298 (1992).
4Karikó, K., Muramatsu, H., Ludwig, J. & Weissman, D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic acids research 39, e142, doi:10.1093/nar/gkr695 (2011).
5Kauffman, K. J., Webber, M. J. & Anderson, D. G. Materials for non-viral intracellular delivery of messenger RNA therapeutics. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 240, 227-234, doi:10.1016/j.jconrel.2015.12.032 (2016).
6Hager, S., Fittler, F. J., Wagner, E. & Bros, M. Nucleic Acid-Based Approaches for Tumor Therapy. Cells 9, doi:10.3390/cells9092061 (2020).
7Weissman, D., Pardi, N., Muramatsu, H. & Karikó, K. HPLC purification of in vitro transcribed long RNA. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 969, 43-54, doi:10.1007/978-1-62703-260-5_3 (2013).
8Pardi, N., Hogan, M. J., Porter, F. W. & Weissman, D. mRNA vaccines — a new era in vaccinology. Nature Reviews Drug Discovery 17, 261-279, doi:10.1038/nrd.2017.243 (2018).
9Pardi, N. et al. Zika virus protection by a single low-dose nucleoside-modified mRNA vaccination. Nature 543, 248-251, doi:10.1038/nature21428 (2017).
10Corbett, K. S. et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature 586, 567-571,doi:10.1038/s41586-020-2622-0 (2020).
11 Anderson, E. J. et al. Safety and Immunogenicity of SARS-CoV-2 mRNA-1273 Vaccine in Older Adults. The New England journal of medicine, doi:10.1056/NEJMoa2028436 (2020).
