二代测序，你了解多少？（三）—

上周我们为大家讲解了二代测序的开山鼻祖，Roche公司的454测序技术。

这周，让我们来聊一聊，ABI公司的SOLiD测序技术。

历史

ABI公司的SOLiD测序技术最初是由哈佛大学 Church 研究小组成员Shendure等所发明的，该技术由连接酶测序法发展而来。

Church 研究组发明的方法的一部分授权给了Agen-court 公司，该公司在 2006年7月被美国应用生物系统公司 (Applied Biosystems lnc, ABI) 收购，组建 SOLiD 测序平台。

原理

SOLiD测序技术以8碱基四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。

SOLiD 测序仪也采用了454技术中乳液PCR 与微球相结合的策略来扩增DNA 模板，其采用边连接反应边进行合成测序，而不是采用聚合反应。

（小编提示：乳液PCR的知识上周刚讲过哦！）

测序步骤

步骤 1丨文库制备

1.文库制备

SOLiD 测序平台支持两种测序文库，一种是片段文库，另一种为末端配对文库。

片段文库就是将基因组DNA打断，在片段的 DNA 模板两端加上接头制成文库，长度一般为60-110bp。片段文库主要用于RNA-seq、重测序、3’, 5’-RACE、甲基化分析、ChIP-seq等。

末端配对文库是将DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然后用EcoP15酶切，使中间接头两端各有27bp的碱基，再加上两端的接头形成文库，长度一般为120-180 bp。该文库主要应用于全基因组测序、SNP分析、结构重排、CNV等。

步骤 2丨PCR扩增

SOLiD的PCR过程和上周讲过的Roche 454测序技术的方法类似，同样采用小水滴的乳液 PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。

在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR。PCR反应结束后，磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同一DNA模板的扩增产物。

步骤 3丨微珠沉积

乳液PCR 完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，微珠上的模板经过3’修饰，可以与玻片共价结合，SOLiD测序反应就在SOLiD玻片表面进行。每个磁珠经SOLiD测序后得到一条序列。

SOLiD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。

步骤 4丨连接测序

SOLiD测序第二大特点便是双碱基编码原理。测序时向体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和具有3'-XXnnnzzz-5'结构的8聚核苷酸测序探针，探针5'末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。

详细介绍一下探针：

3'-XXnnnzzz-5'

第1、2位（XX）上的碱基是确定的，用来测定模板序列，并第1和2位核苷酸序列（XX）与5′端的荧光标记的种类相对应。

第3～5位的（nnn）表示表示随机序列的核苷酸。

第6～8位的（zzz）指的是可以和任何碱基配对的特殊碱基（该碱基在探针结合后会被切除）。

单向SOLiD测序包括5轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应, 得到原始颜色序列。

每一组读序只能读两个碱基，空三个碱基，再读两个碱基，以此类推，下一组通过加入纽带探针和改变引物位置使读序框向右移动，确保每个碱基都能读到。

SOLiD序列分析软件根据“双碱基编码矩阵”把碱基序列转换成颜色编码序列，然后与SOLiD原始颜色序列进行比较。SOLiD序列分析软件可以对测序错误进行自动校正，最后解码成原始基因序列。

应用领域

ABI 的 SOLiD 测序平台未退出市场之前是二代测序平台中精准度最高的平台，测序准确率较高，然而读长较短，运行较慢，常用于外显子测序，基因突变测序。

但是，因为市场竞争和公司发展等诸多原因，目前该测序平台也已经淡出市场。

二代测序，你了解多少？（三）——ABI SOILD