三十年努力终成泡影：一代明星药物CETP抑制剂的幻灭
2006年12月2日是注定载入制药行业历史的一天。辉瑞在这一天宣布该公司降胆固醇药物torcetrapib一项入组人数超过15000人的III期临床试验失败。虽然辉瑞对torcetrapib的研发投入已经超过8亿美金，但却不得不选择停止开发这个新药项目。
Torcetrapib临床试验失败的消息引起了心血管疾病研究领域乃至整个制药行业的强烈震荡。大家好奇其他开发CETP抑制剂的制药公司会做出怎样的反应。确实有一些制药公司立即停止了CETP项目，但默沙东、罗氏、礼来和安进却没有选择放弃。至于原因，还得从CETP抑制剂的机制和早期研发过程讲起。
I
HDL假说
包括脂肪和胆固醇在内的脂类物质是维持人体正常功能所必须的，但由于脂肪、胆固醇等脂质为疏水性物质，所以必需与载脂蛋白等其他物质结合形成脂蛋白 (lipoprotein) 才能在血液中运输。脂蛋白按体积大小和密度分类可分为乳糜微粒，极低密度脂蛋白 (VLDL)，低密度脂蛋白 (LDL)以及高密度脂蛋白 (HDL)几种主要类型。每一种脂蛋白都具有特定的功能。
回肠吸收的胆固醇和甘油三酯以乳糜微粒的形式转运到淋巴并进入血液，甘油三酯在被脂蛋白脂肪酶水解形成甘油和脂肪酸后被肌肉和脂肪组织吸收，而包含胆固醇酯的乳糜微粒残余物能够进入肝脏，与肝细胞表面特定受体结合之后经内吞作用进入肝细胞。胆固醇可在肝脏中被氧化并以胆汁的形式排出进入胆固醇运输的内源性通路。
在内源性通路中，胆固醇与新和成的甘油三酯以VLDL的形式运输至肌肉和脂肪组织，甘油三酯被水解后以甘油和脂肪酸的形式被这些组织吸收。在这个过程中VLDL中的甘油三酯减少，体积逐渐变小，但胆固醇酯却无法被吸收，最终VLDL会形成包含大量胆固醇酯的脂蛋白LDL。而LDL与VLDL的功能具有明显差别，细胞可以通过能够识别apoB-100的LDL受体介导的细胞内吞来摄取LDL获得细胞类固醇合成以及镶嵌进入细胞膜所需的胆固醇。但LDL在动脉粥样硬化的病理过程中也具有十分重要的作用。
LDL能侵入动脉血管内膜并逐渐被氧化，氧化后的LDL能够对内皮细胞产生损伤并引发炎症反应，使内皮细胞表达VCAM-1募集血液中的单核细胞进入动脉内膜。单核细胞分化形成巨噬细胞后可吞噬氧化的LDL，并逐渐形成胞内含有大量脂质的泡沫细胞。而泡沫细胞会逐渐死亡并释放氧化的脂质，进一步诱导炎症反应。与此同时泡沫细胞能够诱导平滑肌细胞向内膜迁移、增生，促进胶原蛋白形成导致动脉内膜斑块的硬化。
在斑块几十年的形成过程中，患者不会产生明显症状，但随着斑块逐渐增大及硬化，斑块形成的位点可能产生血管破裂。而一旦形成血管破裂会立即引发凝血阻塞血管。血管完全阻塞会导致心肌缺血损伤，该过程也被称为心肌梗死。虽然LDL并不是诱发包括动脉粥样硬化的唯一因素，但从以上过程中也能够很清楚的理解LDL在病理过程中的重要性，这也是LDL中的胆固醇 (LDL-C) 被称为坏胆固醇的原因。
动脉粥样硬化
体内存在另一种被称为胆固醇逆转运 (reverse cholesterol transport, RCT) 的生理机制，能够将泡沫细胞中的胆固醇向肝脏转移。而HDL是介导这一过程的重要组分，我们也时常把HDL中的胆固醇 (HDL-C)称为好胆固醇。基于以上现象科研人员也提出了HDL假说：血液中HDL浓度的降低阻碍了胆固醇从动脉血管内膜的清除，加速动脉粥样硬化的形成，从而导致缺血性心脏病。HDL假说有两个潜在的重要论点：一是RCT过程部分依赖HDL功能，二是低HDL水平的人群罹患心血管疾病的风险高于高HDL水平的人群。
那么如何基于HDL假说来研发药物呢？虽然理论上来讲明显影响RCT过程的分子都可能成为药物研发的靶标，但RCT是一个非常复杂的过程。科研人员最初很难确定影响该过程的关键分子。
最终，科研人员将目标锁定在CETP（胆固醇酯转移蛋白）上。CETP主要由肝脏分泌，进入循环系统后可以结合HDL颗粒，能够介导胆固醇酯由HDL向LDL以及VLDL转移，从而影响不同脂蛋白中胆固醇的含量。科研人员之所以关注CETP是基于一项流行病学研究。1990年11月《新英格兰医学杂志》上刊登了一篇论文 [1]，报道了一个日本家族中家庭成员由于基因缺陷使CETP蛋白功能具有缺陷，从而导致体内HDL水平升高，而且没有证据显示具有该基因缺陷的家族成员会过早罹患动脉粥样硬化。
虽然有证据证明CETP水平与HDL的相关性，但不同的实验得出的结论却并不一致 [2]。例如流行病学研究发现一些人体内虽然没有CETP，但仍然有可能罹患心血管疾病。科研人员也研究了小鼠和兔子动物模型中CETP的活性，小鼠的模型的研究结果不一致，难以得出让人信服的结论。但针对兔子的研究却发现抑制CETP能够提高HDL水平，降低动脉粥样硬化的发生率。但从理论角度考虑，一些人也在担心抑制CETP会导致体积巨大而且功能异常的HDL/LDL在体内累积。尽管如此，几家制药公司仍然迅速启动了CETP抑制剂的研发，毕竟只有通过临床试验才能验证抑制CETP究竟能不能影响心血管事件的发生率。
制药公司对于CETP抑制剂的热情不仅是基于这些早期的流行病学研究和动物模型实验数据。尽管当时已经有多款他汀类药物上市，但该类药物只能够降低大约25%的主要心血管事件风险。心血管疾病依然是全世界范围内导致人死亡的首要因素，而且大约有五分之一使用他汀类药物的人群会产生药物相关副作用。因此进一步降低心血管疾病风险，寻找替代药物成了制药公司关注的重点。
病人胆固醇相关问题并不仅局限于LDL水平过高，有的病人还会出现HDL水平过低以及甘油三酯水平过高的问题。因此寻找能够与他汀类药物产生协同作用的，能够降低甘油三酯水平，提高HDL水平的药物是当时药物研发的重要方向。
II
折戟
《新英格兰医学杂志》的文章发表后不久，辉瑞就开始了CETP的研究项目。但研究人员发现CETP抑制剂的分子设计和优化极其困难。CETP是一个亲脂性极强的蛋白，筛选得到的抑制剂不仅活性不强，水溶性也极差。项目开始之后的几年时间内，药物化学家筛选了几十万个小分子，但依然没有找到一个性质符合要求的化合物，该项目也几度面临中止。
辉瑞的项目主管让一位名叫Roger Rugger的年轻人接手做最后的尝试。Rugger不久便发现一个能够与CETP产生弱相互作用的小分子，经过不断的结构优化之后使活性提高了100倍。虽然该小分子的溶解性依然非常差，但在制剂专家的帮助下他们最终还是完成了临床前研究。这个完成临床前研究的小分子化合物正是torcetrapib。
1999年torcetrapib进入了I期临床研究。研究人员发现torcetrapib不仅能够剂量依赖性地明显提高HDL-C水平，还能够显著降低LDL-C水平，这显然大大超出了研究人员的预期。辉瑞对于这些临床试验结果感到无比兴奋。而且torcetrapib的安全性并不存在明显问题，只是研究人员发现在高剂量的条件下患者会出现血压升高的现象。
辉瑞的临床研究也引起了其他制药公司的关注。同期，罗氏收购了Japan Tobacco的dalcetrapib，默沙东和礼来也加快了CETP项目的研发进度。然而torcetrapib在II期临床试验中出现了比较奇怪的现象。研究人员发现torcetrapib对不同病人的LDL水平影响并不一致，一些病人LDL水平下降，而有些病人的LDL水平却明显升高。但他们发现联用他汀类药物后这种差别会消失。因此在III期ILLUMINATE研究中，研究人员选择了torcetrapib与立普妥联用，评价该方案对比立普妥在心血管事件影响上的差异。
ILLUMINATE的单个临床试验预算将近8亿美金，这可能是当时整个制药行业中最贵的一项临床试验了。虽然早期的临床数据显示torcetrapib能够提高HDL水平，而且联用阿托伐他汀能够降低LDL水平，但HDL/LDL水平变化究竟能不能转化为心血管获益仍然是未知数。
2006年12月2日，辉瑞宣布了ILLUMINATE临床试验的结果：torcetrapib/阿托伐他汀联用组死亡人数明显高于对照组 (82 vs 51)，临床试验失败。辉瑞也在同期宣布停止torcetrapib的临床开发。辉瑞的CETP项目经历了15年的时间，最终还是没有胜利。
III
锲而不舍
辉瑞的研究人员在torcetrapib的早期临床研究中发现该药物能够引起血压的升高。但由于血压升高的程度并不是很大，所以辉瑞本公司的员工以及外部专家一致认为血压升高所带来的影响能够被torcetrapib提升HDL所产生的健康获益所抵消，所以在没有进行进一步研究的情况下就开始了III期临床研究。
辉瑞显然低估了这一副作用的影响。现在回头来看，辉瑞当时更明智的选择是放弃torcetrapib，选择没有高血压副作用的其他CETP抑制剂重新开始临床研究，但当时的辉瑞显然不同意这种策略。快速推进CETP抑制剂torcetrapib的临床研究显然不仅仅是基于未满足的临床需求，考虑到立普妥的专利过期问题，辉瑞当时的管理层面临着巨大的压力，因此全力推进torcetrapib的临床研究从某种程度上讲也是无奈之举。虽然从科学的角度开看放弃torcetrapib，选择其他candidate是更加合理的选择，但这也同时意味着药物潜在的上市时间必须往后推迟几年，辉瑞等不起。
在torcetrapib临床试验失败之后，ILLUMINATE项目的研究人员便开始分析临床试验失败的原因。他们通过分析病人的血液指标发现几个与病人死亡风险上升相关的因素：病人血钾水平降低，血钠水平以及碳酸盐水平升高，醛固酮水平升高 [3]。因此研究人员推测torcetrapib临床试验的失败是由于脱靶效应引起的。
与此同时其他正在进行CETP抑制剂开发的制药公司也在积极寻找torcetrapib失败的原因，并且开始反复验证自家CETP抑制剂的安全性。
当辉瑞宣布torcetrapib临床试验失败的时候大家都无法确定是由于CETP靶点本身还是药物分子缺陷导致了试验失败。因此默沙东延缓了自家CETP抑制剂anacetrapib的开发进度，重点研究该药物的毒性作用。默沙东在临床前动物模型研究中发现，虽然torcetrapib能够引起血压和醛固酮水平升高，但他们自家的anacetrapib并不会产生这样的作用 [4]，而且在临床研究中也没有发现anacetrapib使醛固酮水平和血压升高的现象。因此他们推测血压升高只是torcetrapib本身缺陷产生的脱靶效应引起的。
默沙东还进一步研究了CETP抑制剂以及HDL的详细作用机制，对比anacetrapib, torcetrapib以及罗氏的dalcetrapib对于CETP以及HDL功能的不同影响 [5]，还发现服用anacetrapib的病人能够提高HDL的保护作用 [6]。于是默沙东小心翼翼地把临床研究继续向前推进。
一开始，他们只是进行了一项只有1600例病人的中等规模临床试验，代号DEFINE。DEFINE研究发现，anacetrapib并不像torcetrapib那样会提高心血管疾病风险，而且分析后发现服用anacetrapib的病人LDL水平能够降低39.8%，HDL水平提高138.1%。于是默沙东启动了另一项超过30000名病人的REVEAL临床研究，以确定抑制CETP是否能够降低心血管事件的风险。
在辉瑞宣布torcetrapib临床试验失败的时候，礼来的evacetrapib尚处于临床前研究。早在2004年辉瑞报告torcetrapib能够引起血压升高的时候，礼来就开始筛选不会引起高血压的CETP抑制剂。而在辉瑞报告torcetrapib能够引起电解质失衡以及醛固酮水平升高之后 [3]，他们也开始进行体外实验以验证evacetrapib是否具有同样的性质 [7]。
Evacetrapib的I期临床研究同样小心翼翼，礼来对该药物的性质进行了详细的研究，然而并没有发现该药物能够产生明显副作用，而且也没有出现血压升高、电解质失衡等现象。II期临床试验结果则显示evacetrapib能够提高使HDL水平129%，LDL水平降低36% [8]。
在torcetrapib临床试验失败之后，罗氏也开始更加细致地研究dalcetrapib的安全性。罗氏在进行一项15600例患者大型III期临床试验 (dal-OUTCOMES) 的同时又开展了两项IIb期临床研究（代号dal-VESSEL以及dal-PLAQUE）来研究药物的安全性 [9]。两项安全性临床研究显示dalcetrapib能够使HDL水平提升31%而且并不会引起高血压。dal-PLAQUE则使用造影术来研究dalcetrapib治疗对于动脉管的影响，在服药两年后他们也没有发现病人动脉血管壁异常 [10]。
即便各家公司如此小心翼翼，也没能换来期望的结局。2012年罗氏因为dalcetrapib无法产生预期疗效中止了临床研究。2015年10月，礼来宣布evacetrapib的三期临床试验ACCELERATE失败，evacetrapib相比安慰剂无法降低心血管事件的发生率。
今年6月，默沙东公开了anacetrapib的III期临床试验REVEAL的结果：anacetrapib/阿托伐他汀相比安慰剂/阿托伐他汀心血管事件的发生率分别为10.8% 和11.8%。虽然达到了主要终点，但仅降低9%的心血管事件风险显然无法与疗效更确切的PCSK-9抑制剂同台竞争。今年10月默克宣布放弃anacetrapib的上市申请。受默克的anacetrapib影响，安进也随即宣布放弃自家CETP抑制剂obicetrapib的开发。
IV
逻辑线
我们来看一下CETP抑制剂作用机制的逻辑线：CETP抑制剂--抑制CETP蛋白功能--提高HDL-C水平--影响HDL功能--影响RCT过程--影响心血管疾病(CVD)的发生率。到底哪里出了问题？
默沙东，罗氏和礼来均认为辉瑞的CETP抑制剂失败的原因可能是torcetrapib药物分子本身的缺陷导致的脱靶效应，因此才产生血压升高，电解质失衡以及醛固酮水平异常等问题。对于很多小分子药物靶点来说，前期合理的化合物设计和结构优化过程确实有可能提高小分子的选择性，减少脱靶效应。anacetrapib，dalcetrapib以及evacetrapib也确实没有出现torcetrapib升高血压等方面的缺陷。抑制CETP蛋白功能环节存在问题的可能性很小。
那么抑制CETP是否会提高HDL-C水平呢？我们来看一下礼来evacetrapib这方面的数据，HDL升高125%，LDL降低30% [11]，所以还要啥自行车？但问题是提高HDL-C水平又怎样呢，evacetrapib对心血管事件的发生率完全没有影响。
问题的关键在于HDL-C与CVD的关系是怎样的？
首先需要注意的是HDL假说是基于HDL的保护作用，而不是HDL-C，因此临床试验中要验证的是HDL的保护作用，而非HDL-C。影响HDL功能的因素也不仅局限于HDL-C水平，还包括HDL粒子数量，pre-β-HDL水平以及其他HDL组分。但是由于HDL水平很难检测，所以临床试验中一直使用HDL-C作为检测指标。而且影响HDL-C水平的因素很多，但并不是所有的HDL-C水平变化都与RCT过程相关。
接下来最关键的问题是HDL的功能与CVD有什么相关性？换句话说，HDL假说是否成立呢？很遗憾现在依然没有定论。可能HDL确实具有保护作用，可能RCT确实能够减缓动脉粥样硬化的疾病进程，但由于HDL的成分非常复杂，现在无法确定到底何种类型的HDL具有保护作用，或者确定CETP抑制剂影响的是何种类型的HDL，所以才产生了anacetrapib有微弱的CVD保护作用，torcetrapib增加病人的死亡率，而evacetrapib没有任何CVD保护作用这样的明显差异。
但anacetrapib的CVD保护作用也可能是由于降低LDL产生的，而HDL与CVD也可能只有相关性而没有因果关系，也就是说HDL假说是错误的。但这也只是猜测而已。现在依然有很多HDL假说的研究和验证性实验，希望我们未来能够得到满意的答案。
看过笔者之前写的阿尔茨海默症文章的读者 (见：阿尔茨海默病的新药研发困局)，应该会对HDL假说有似曾相识的感觉。HDL假说与淀粉蛋白假说有很多相似之处，而且CETP抑制剂与基于淀粉蛋白假说的BACE抑制剂的开发过程有很多相似之处。对于药物化学家来说，基于BACE和CETP这两个靶点来开发药物都非常艰难，而最终药物化学家们都成功获得了活性高且理化性质可接受的化合物。但由于我们对心血管疾病和阿尔茨海默病认识的不足，这些化合物都没有顺利通过临床实验。
可能国内有的刚接触新药研发的学生或者科研人员会对新药研发领域产生一种错觉，以为做新药无非就是改改剂型或者做me-too或者me-worse。我刚进实验室的时候，有一天老板也突发奇想提议做CETP抑制剂，把这个选题交给了和我同期进实验室的王姓同学，告诉她先合成anacetrapib练练手再做结构改造。王同学花了很长时间才合成出anacetrapib，但由于老板没有联系到合适的课题组做活性筛选，这个课题也就不了了之了。
有时候会很羡慕那些在Genentech或者默沙东这样的制药巨头工作的药物化学家们。他们是新药研发领域全球最顶尖的科学家，他们有着别人难以企及的资源，所从事的项目难度令人望而生畏。而且我一直偏执地相信这些公司里有这样一群人，驱使他们工作的不是所谓的业绩，不是手里股票的涨跌，而是对科研最纯粹的热情，对未知的好奇，以及对治病救人的责任感。
——In Memory of My Beloved Grandmother.
参考文献:
1. New England Journal of Medicine. 323:1234-1238. 1990.
2. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37(11)1-9. 2003.
3. New England Journal of Medicine. 357:2109-2122. 2007.
4. British Journal of Pharmacology. 154(7):1465-73. 2008.
5. Journal of Lipid Research, 51:2739-2752. 2010.
6. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology.30:1430-1438. 2010.
7. The Journal of Lipid Research, 52:2169-2176. 2011.
8. JAMA.306(19):2099-2109. 2011.
9. Current Medical Research and Opinion. 27:463-480. 2007.
10. Lancet. 378:1547–1559. 2011.
11. New England Journal of Medicine. 376:1933-1942. 2017.
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