关于MDS、AML的二代测序临床答疑
什么是二代测序？
二代测序 (NGS，next generation seqence)，是新一代的DNA测序技术，2005年发展至今，技术已趋成熟，目前二代测序已成为中国临床肿瘤医生常用的检测工具。
二代测序的优点
1. 高通量：二代测序技术最显著的特征是高通量。一次能对几十万条到几百万条遗传物质分子进行测序，使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。
2. 低成本、高准确性：与一代测序相比，二代测序在大大降低了测序成本的同时，大幅提高了测序速度。并且保持了高准确性。人们可以以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组和转录组的各项数据。
中国临床肿瘤学会（CSCO）肿瘤生物标志物专家委员会发布的第一个NGS临床应用调研显示, 大于30%的肿瘤科医生每月NGS检测量超5个, 而中国超过90%的临床医生需要NGS报告解读的支持。故本文整理了临床常见的几个问题及解答，以供参考。
Q1：基因突变报告单病理意义解读的关键点
A:
在造血组织肿瘤中，基因突变报告单病理意义解读需要重点关注以下几点：
1、基因突变类型是否是属于具有临床意义的突变类型，推荐实验室建立一个详细的基因突变位点注释数据库。
2、基因突变结果需要结合患者血常规、骨髓形态学检查，流式免疫分型，染色体核型分析等等检查结果，才能对基因突变进行准确的病理意义解读，包括疾病诊断、预后判断、靶向治疗等等。
3、基因突变报告单的检测范围和检测灵敏度。基因突变检测报告单是否包含所有能够对疾病诊断、预后分层或靶向治疗的位点或类型；检测灵敏度是否能够满足临床检测需求。
4、基因突变检测平台需经过临床试验验证，防止由于方法学建立时的缺陷导致的漏检。
Q2：二代测序报告中哪些基因的变异有诊断意义？哪些基因的变异可以用于预后评估？
A:
· 在2021年NCCN骨髓增生异常综合征治疗指南中，列表中常见的体细胞突变类型能够作为具有临床意义的突变类型。
对于具有临床意义的突变位点，需要经过大数据分析、临床试验或功能性研究方能加入具有临床意义的突变位点解释范围，这部分突变位点的病理意义解读需要基因突变检测实验室的数据库资料积累。
Q3：突变比例达到多少才具有诊断或预后评估的意义?
A:
当前国际大数据统计分析及临床试验中基因突变检测灵敏度大部分为2%。因此当前国际上公认基因突变比例≥2%才能作为造血系统疾病的诊断或预后评估的指标。当基因突变比例低于2%时，该基因突变是克隆性造血相关基因突变的可能性大大增加。随着检测技术的发展和临床试验的不断开展，不排除隐匿性致病突变具有相应的临床意义。
Q4：报告中AR值的意义是什么？
A:
出现FLT3-ITD突变时会附上相应的AR值，AR值是指等位基因的比率（Allelic Ratio，AR），特指采用毛细管电泳法检测到的突变型峰面积与野生型峰面积的比值。NCCN指南、ELN指南明确提出将AR值作为AML的预后评判指标。当FLT3-ITD AR≥0.5属于高比例突变，AR＜0.5属于低比例突变，结合NPM1基因突变，来对AML的低危组、中危组、高危组进行危险度分层。
Q5：临床意义不明确的变异该如何解读？
A:
虽然某些基因属于指南中具有临床意义或者预后提示的基因，但是没有足够的询证医学来验证该基因的某些突变位点可以作为诊断或预后评估的指标。例如2021 NCCN MDS指南明确提出，SF3B1基因只有E622, Y623, R625, N626, H662, T663, K666, K700E, I704, G740, G742, D781这些位点发生突变才能作为疾病诊断标准，如果出现其它突变位点，需要进一步收集临床资料进行分析或进行前瞻性的临床试验才能明确临床意义。
Q6：预后良好的基因与预后差的基因同时出现，如何解读？
A: 需综合考虑
1. 需要结合患者的疾病类型、其它检查结果并根据指南优先等级综合考虑。
在AML（非APL）中需要结合染色体结果进行综合判断。如出现AML1-ETO融合基因阳性伴随FLT3-ITD突变，或CEBPA双等位基因突变伴随FLT3-ITD突变，国际上多篇文章提示这类患者预后较差。现行的NCCN指南及ELN指南提示AML（非APL）患者发生FLT3-ITD突变，需要根据NPM1突变并结合FLT3-ITD突变比例进行预后分层。如AML1-ETO融合基因阳性的AML患者，NPM1突变阳性伴随FLT3-ITD低比例突变就是低危组，NPM1突变阳性伴随FLT3-ITD高比例突变（或NPM1突变阴性伴随FLT3-ITD低比例突变）就是高危组。但是，并没有明确的临床试验和文献报道称AML1-ETO融合基因阳性伴随ASXL1、RUNX1等其它预后不良的基因提示预后差，可能病例数较少还没有达到统计学差异，因此，根据现行的NCCN及ELN指南，AML1-ETO融合基因阳性伴随ASXL1、RUNX1等预后不良的基因突变依旧属于低危组。
2. 根据患者治疗方案考虑。
在AML中，最早NCCN指南将AML1-ETO融合基因伴随KIT突变列为中危组，但是随着治疗方案的改进及大数据的积累，KIT基因突变对预后无影响。也有文献报道AML1-ETO融合基因伴随KIT突变虽然会导致预后差，但是总体预后仍然好于中危组。因此，现行ELN和NCCN指南已经把KIT基因突变从预后分层中取消。如果患者采用NCCN指南中治疗路径，则属于低危组，化疗缓解后可不用行骨髓移植，故患者的预后评估需要根据是否进行规范的化疗方案来综合评判。但是根据国内《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）》治疗路径，AML1-ETO融合基因伴随KIT突变在AML中属于中危组。AML1-ETO融合基因伴随KIT突变在AML中是否改为低危组，还有待于国内近几年AML治疗路径的进一步发展及数据进一步积累。
Q7：预后良好的基因与预后差的基因同时出现，患者是否需要移植？如需移植，移植的时机是怎样的？
A:
以AML为例，因国内外治疗方案不一致，根据国内《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）》，在国内现有治疗方案及路径的选择下，低危、中危和高危组均推荐化疗缓解后做骨髓移植。而2021 NCCN AML指南，根据患者染色体核型和基因突变分层，低危组在化疗缓解后不需要移植（国外治疗路径下低危组化疗预后与移植预后无统计学差异），中、高危组推荐化疗缓解后推荐移植。
移植时机需要考虑多种因素。单从基因突变的角度出发，在规范的治疗路径下，并且患者满足其它移植条件时，通过流式、基因突变监测MRD，当骨髓中肿瘤细胞比例达到最低时，为最佳的移植时机。 近期也有相关文献报道，移植前超深度测序分析基因突变，对移植后复发具有重要提示意义。
需要特别注意的是，对于疾病进展较快的特殊亚型，比如伴有FLT3-ITD突变的AML，移植窗口期较短，国内外有文献报道可以通过移植前使用FLT3抑制剂进行靶向治疗来降低FLT3-ITD的突变比例或者移植后持续使用FLT3抑制剂来提高移植预后。
二代测序是一个强大的功能平台，它可以同时给数以万计的DNA分子进行测序。由于这种可以多个样本同时测序的能力，在个性化医疗、遗传疾病和临床诊断等方面，二代测序开创了革命性的领域。
二代测序可应用于全基因组测序（whole genome resequencing, WGS）和全外显子组测序（whole exome resequencing, WES），可获得点突变、小片段插入或缺失、拷贝数变异和结构变异的信息。同时，研究人员可利用强大的生物信息学工具，破译大量数据，加深我们对疾病的理解，并制定个性化的诊疗策略。
二代测序在肿瘤中的一些研究成果已应用于临床，为疾病的早期筛查、预后判断和靶向用药提供了有力的依据。随着二代测序技术的不断发展和对癌症研究的不断深入，二代测序技术将为癌症治疗的突破提供新的希望。
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