miRNA预后模型的6+分思路
A Distinctive microRNA (miRNA) Signature in the Blood of Colorectal Cancer (CRC) Patients at Surgery在术前结直肠癌患者血液中发现的独特miRNA Signature
一、研究背景
主要基于患者血液的液体活检技术的产生及发展为癌症相关检查提供了新的途径，而目前已有在结直肠癌(CRC)患者血液中发现特征性的miRNA的报道，但研究局限于晚期CRC患者，作者希望通过对CRC早期患者的血液研究筛选出可用于早期CRC筛查的特征性miRNA signature。
二、研究流程
三、结果解读
1.miR-141, miR-221和miR-222在CRC病例中的表达情况
miR-141-3p, miR-221-3p和miR-222-3p这三个miRNA曾被报道在CRC患者的血液中浓度提高，然而在这些早前的研究中，miRNA的筛选都是基于晚期CRC患者的相关数据。因为早期CRC的筛查相对于患者意义更大，因此作者希望探究这3个miRNA在CRC的早期阶段或者说在更小的肿瘤负荷之下的血浆浓度异常。为此，作者对35名新近诊断为早期CRC的患者采集了血样，使用微滴数字式反转录PCR(dd-RT-PCR)对血浆miRNA进行测量，6名无肿瘤志愿者的血样也被纳入分析作为参考。miRNA在无肿瘤志愿者及CRC患者的表达情况如图1A，dd-RT-PCR的代表性结果如图1B。作者对PCR结果进行分析发现，仅有11名(31.4%)患者miR-141-3p的水平升高(图1C)，而miR-221-3p和miR-222-3p水平升高的患者也仅为11名(31.4%)和8名(22.8%)。即使把3个miRNA同时纳入考虑，也只有20名(57.1%) CRC患者出现至少一种miRNA的上调。基于这些结果，作者认为上述3个miRNA无法用于区分早期CRC和无肿瘤志愿者。因此，作者希望通过进一步探索寻找鲁棒性更高的适用于预测早期CRC的miRNA signature。
图1A.先前报道的3个miRNA在本实验中CRC患者和无肿瘤志愿者血浆中的浓度比较；图1B.上述miRNA在dd-RT-PCR中的代表性结果
图1C.上述3个miRNA在不同患者/无肿瘤志愿者中的血液浓度一览表
2.筛选CRC早期的特征性miRNA分子
作者从CRC患者和无肿瘤患者队列中分别随机抽取了5个和3个样本进行NGS(第二代测序)并基于NGS数据进行了无监督层次聚类(图2A)和主成分分析(图2B)。为了精选早期CRC相关的miRNA signature，作者首先将fold change的cutoff值设为2，筛选出26个差异表达的miRNA(图2C)。接下来，作者进一步删除了在无肿瘤志愿者中表达差异较大(SD>2.5)或者在dd-RT-PCR中测得的水平较低(<0.2 copies/µL)和未被探测到的miRNA。最终得到了9个候选miRNA(图3A)，其中包括5个在早期CRC患者中上调的和4个在早期CRC患者中下调的miRNA(图3B)。作者基于这9个miRNA在更大的样本中进行了dd-RT-PCR检测，代表性结果如图3C，D。
图2A.对8个样本NGS数据的聚类结果；图2B.基于NGS数据的主成分分析；图2C.8个样本中表达差异较大的26个miRNA
图3A，B.筛选得到的9个miRNA的概况
图3C，D.dd-RT-PCR的代表性结果
3.筛选得到的9-miRNA signature的评估
图4和5A总结了9个miRNA signature在无肿瘤志愿者和CRC患者血液中的浓度。与作者的预料一致的是，相对于上述进行NGS的8个患者和无肿瘤志愿者，基于所有患者和无肿瘤志愿者的检测结果相互之间的差异更大。尽管如此，作者仍发现了在患者与志愿者血浆间存在显著浓度差异的两个miRNA——miR-584-5p和miR-144-3p。尽管9个miRNA中的任意一个都难以独立作为有价值的预测分子，但除一名患者以外，其它患者均出现了9个miRNA中2-8个的调节异常。因此，同时考虑9个miRNA血浆浓度的9-miRNA Signature在本研究中对早期CRC有一定的预测价值。在比较了相关研究数据后，作者发现某些患者上述9个miRNA中的某几个会出现非常显著的上调或下调，提示它们还可作为miRNA疗法的候选靶点。
PCA的结果显示这9个miRNA可被分成差异较大的3类(图5B)，在set1和set2中发现的miRNA浓度的相关性提示这9个miRNA之间存在一定的共调节关系。
为了进一步精简用于早期CRC患者筛查的signature，作者依据PCA结果选出3个miRNA——miR-144-3p(Set-1)，miR-584-5p(Set-2)和miR-1247-5p(Set-3)。分析发现31名患者至少出现其中2个miRNA的调控异常，对比来看，仅有23名患者出现先前报道的3个miRNA的特异性调控异常，说明早前文献报道的miRNA signature对早期CRC的筛查能力明显更低。另外，作者对比分析了不同组合的miRNA signature对CRC的预测性能，发现将9个miRNA的全部或部分与先前报道的3个miRNA共同组合成新的Signature都能提高后者对早期CRC的预测能力。但考虑到CRC中miRNA的高度异质性，可能需要进一步分析以及更多的病例来确证作者的结果。
图4.各个患者/无肿瘤志愿者血浆中miRNA的浓度情况一览表
图5A.9个miRNA在CRC患者与无肿瘤志愿者血浆中miRNA的浓度比较
图5B.对9个miRNA的主成分分析结果
4.miRNA血清水平与KRAS突变的联系
KRAS突变在癌症中较为常见，有报道称其可作为EGFR阻断疗法疗效的预测标志，故作者将他们的样本分为两组——KRAS野生型和突变型，图6展示了不同miRNA在两组之间的血清水平，其中miR-425-3p和miR-141-3p在KRAS突变型患者中表达显著更高，而miR-15b-5p在显著性阈值边界(p=0.054)。因此，作者得出结论，miR-425-3p和miR-141-3p以及可能的miR-15b-5p与KRAS突变相关，其它的未观测到显著相关性的分子可能需要在更大的样本量下进一步探索。
图6.KRAS突变与miRNA血清浓度的联系
小结
作者的研究思路并不复杂——首先检验了先前报道的miRNA标志物，发现其在早期CRC筛查中的缺陷，随后通过设置多个条件筛选出了3个可作为CRC早期筛查的标志miRNA，最后还探究了热点基因KRAS突变与血浆miRNA浓度的差异。但作者的成功之处可能在于以液体活检技术作为研究基点，因为该技术相对较新，且有相当的发展空间，故相关文章的创新性也容易保证。