肝癌miRNA预后标志物都发了4分，你也可以！
The chromosome 19 microRNA cluster, regulated by promoter hypomethylation, is associated with tumour burden and poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma19号染色体microRNA簇受启动子低甲基化调节，与肝细胞癌患者的肿瘤负荷和不良预后有关
一. 研究背景
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)仍然是预后不良的主要恶性肿瘤之一，也是发展中国家癌症死亡的主要原因之一，少数患者受益于各种外科手术治疗和靶向辅助治疗。但是，由于缺乏临床表现，导致肿瘤进展，HCC的预后仍然有限，因此，至关重要的是更好地了解HCC相关分子机制，以发现有效的诊断标准和治疗方法。即使在体内或体外证实了单个miRNA的作用，也可能太弱而无法逆转肿瘤微环境中的肿瘤发生和肿瘤进展，因此，本文就致力于探索与肿瘤相关途径协同作用的miRNA。
19号染色体microRNA簇(C19MC)是最大的miRNA簇，具有59个成熟miRNA的高产量。其功能和调控机制在HCC中尚不清楚。而且，由两个或多个miRNA组成的miRNA簇不仅对其相邻的蛋白质编码基因具有特异性，而且还可能具有共同的功能。为此，作者提出两个假设：
一方面，有一种统一的方法来调节C19MC中所有miRNA的表达
另一方面，C19MC miRNA可能对HCC具有惊人的显著影响
二. 分析流程
三. 结果解读
1. C19MC在肝癌中表现出全面而持续的高miRNA表达水平。
从TCGA获得了373个HCC和50个非肿瘤样品的总miRNA图谱。在使用edgeR包进行统计分析后，筛选出基于其表达水平的倍数变化值(fold‐change values)差异表达的miRNA。得到C19MC表达的46个miRNA的信息。
发现位于C19MC中的所有46个miRNA与非肿瘤样品相比，均显示出高和正的倍数变化值(图1a)；之后提取数据应用可视化无监督分层聚类来评估C19MC miRNA的差异表达，结果表明HCC样品中C19MC miRNA的表达水平高于非肿瘤样品(图1b)。
图1. C19MC miRNA在HCC中始终显示高表达水平
2. C19MC miRNA的表达水平与启动子低甲基化有关
为了探索触发C19MC miRNA特异性上调的机制，作者评估了C19MC启动子的甲基化水平以及甲基化与表达水平之间的相关性。使用了来自TCGA的甲基化数据，并获得了C19MC启动子相关CpG的β值进行分析。
得到来自50个非肿瘤样本和373个HCC样本的C19MC甲基化水平的热图。颜色代表甲基化水平，范围从0到1(图2a)。之后，进一步确定了每种miRNA差异表达的影响。结果表明在HCC样品中所有C19MC启动子的甲基化水平均显着降低且均一降低，证明HCC样品中C19MC基因表达高(图2b)。
图2. 启动子低甲基化上调了C19MC的表达
3. C19MC的高表达水平与组织病理学特征和存活率相关
鉴于C19MC miRNA的所有表达水平在HCC中普遍上调，作者进一步旨在检测这些miRNA的表达是否与HCC患者的组织病理学特征和生存率相关。使用Mann-Whitney检验进行统计分析，结果表明，T期高的HCC显示出C19MC miRNA高表达水平的统一趋势。其中，T分为低T阶段和高T阶段，一般代表原发部位肿瘤的大小(肿瘤负荷)。在肝癌T期中，C19MC miRNA表达水平与较好预后有关。
图3. T期C19MC miRNA表达水平有较好预后
图3的结果，促使作者评估C19MC与患者预后之间的关系。在所有46种miRNA中，高表达的3种miRNA（mir-512-1，mir-516a-1和mir-519a-2）与更差的OS相关(图4a)。进行Kaplan-Meier生存分析，其中将三个miRNA表达水平的中位数设置为临界值。
图4a. 在mir-512-1，mir-516a-1和mir-519a-2表达水平与较好预后有关
森林图描绘了使用临床特征和三种miRNA的表达水平进行生存的单变量分析，结果表明T期，高表达的mir-512-1和mir-516a-1与更差的OS显著相关(图4b)。点表示危险比，误差线表示95％置信区间的值。
图4b. 临床特征和三种miRNA的表达水平生存的单变量分析结果
ROC曲线评估了三种mRNA标记的敏感性和特异性。使用T期作为预后模型，AUC为0.728(左)。加入三种miRNA的标记后，AUC升至0.76(右)。结果表明，高表达的三种miRNA与更差的OS显著相关(图4c)
图4c. 三种mRNA标记的敏感性和特异性的评估
4. 三种miRNA的靶基因预测和功能分析
mir-512-1(左)，mir-516a-1(中)和miR-519a-2(右)从TargetScan(蓝色)，miRWalk(绿色)和miRDB(红色)三个数据库预测重叠靶基因，并用基因通过R的Venny包进行筛选和可视化(图5a)。
图5a. 预测靶基因的重叠部分
为了进行生物信息学分析并探索miRNA标记的潜在机制，作者进一步收紧了3个miRNA的靶基因的重叠——mir-512-1(红色)，mir-516a-1(绿色)和mir-519a-2(蓝色)靶基因进一步重叠。结果表明，共有196个基因可能是3个miRNA的共同靶基因(图5b)。
图5b. 三个mRNA的共同靶基因
为了对miRNA标记进行蛋白质间相互作用分析，我们将196个基因上传到了STRING，蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，在已构建的PPI网络中确定了31个置信度最高的重要节点(图5c)。
图5c. 蛋白质-蛋白质相互作用分析(PPI)
5. 对靶基因进行GO富集和KEGG途径的生物信息功能分析
用DAVID数据库分析和可视化GO注释和潜在途径。作者在GO中提交了图5b中的196个常见基因，分了三个域(domain)：生物过程，细胞成分和分子功能。结果表明，靶基因的功能与信号转导、蛋白结合、转录调节、蛋白磷酸化和MAPK途径有关，并显示了每个域的前十项(图6a)。
图6a. 常见基因在三个域中的分析
KEGG分析得出的与癌症相关的途径(表1)。
表1. KEGG预测基因的癌症相关途径
鉴于MAPK途径与靶基因的KEGG(表1)，GO(图6a)和PPI分析(图5c)相关，作者进一步分析了MAPK涉及的6个靶基因的功能。结果表明，HCC样品中的三种基因MAP3K2，MAP2K4和MAPK10(促分裂原激活的蛋白激酶10)的表达水平下调(图6b)。
图6b. HCC中三个潜在靶基因的表达水平
这三个关键靶基因顺序位于c-Jun N-末端激酶(JNK)轴，这是MAPK途径中的关键轴。结果强烈表明这三种miRNA可能促进了通过抑制JNK轴的功能来侵袭HCC，从而影响HCC的预后(图6c)。红色箭头表示潜在的靶向抑制，其中虚线表示较弱抑制，实线较强抑制。
图6c. 靶向MAPK途径中JNK轴的三个miRNA的示意图