TCGA+自测队列发17+分新思路！
Next-generation RNA Sequencing–based Biomarker Characterization of Chromophobe Renal Cell Carcinoma and Related Oncocytic Neoplasms基于高通量RNA测序的嫌色细胞型肾细胞癌与相关嗜酸细胞瘤的生物标志物表征
一、 研究背景
肾细胞癌（RCC）是一种异质性肿瘤，嫌色细胞型肾细胞癌（ChRCC）约占RCC的5％，分为两类：有大细胞包绕，有清晰的细胞边界，细胞质呈嗜酸性，葡萄干样核和核周常有空晕的经典classic ChRCC ；癌细胞呈腺泡结构，有丰富的嗜酸性细胞质，局灶性胞核皱缩，轻微核周空晕的嗜酸性ChRCC（eosinophilic ChRCC）。尽管大多数病例可以根据形态进行分类，但仍有病例显示出与其他分类相似的形态，包括透明细胞RCC（CCRCC），MiT家族易位性RCC（t-RCC），杂合性嗜酸细胞肿瘤（hybrid oncocytic tumor），嗜酸细胞型乳头状肾细胞癌（PRCC）和肾嗜酸细胞瘤（oncocytoma）。作者结合了TCGA，内部RCC数据和正常人肾单细胞RNAseq（scRNA-seq）数据，重点研究了ChRCC和嗜酸细胞瘤的特征。
本篇研究中涉及到的肾脏肿瘤的名称及缩写：
嫌色细胞型肾细胞癌-ChRCCclassic ChRCC-经典ChRCCeosinophilic ChRCC-嗜酸性ChRCC透明细胞RCC-CCRCC透明细胞乳头状RCC-CCPRCC嗜酸细胞型乳头状肾细胞癌-PRCC肾脏黏液样小管状和梭形细胞癌-MTSCCMiT家族易位性RCC- t-RCC杂合性嗜酸细胞肿瘤hybrid oncocytic tumor-HOT肾嗜酸细胞瘤oncocytoma
二、 分析流程
三、 结果解读
1.癌症和谱系特异性ChRCC生物标志物的获取
作者从TCGA中获得了ChRCC，CCRCC和PRCC的RNAseq数据，以及从密歇根州转化病理学中心（MCTP）获得了rare RCC样本——经典ChRCC（n=33），嗜酸性ChRCC（n= 10），未分类RCC（n= 6），HOT（ n= 7）和嗜酸细胞瘤（n = 18）。利用limma对voom转换后的count进行ChRCC和其他分子亚型以及正常肾脏组织的差异表达分析，鉴定出2751个上调和2107个下调的基因（图1.B）。考虑到MCTP和TCGA数据之间的系统差异，作者已在线性模型将数据来源作为协变量进行分析。
voom转换适用于样本库大小不一的情况，即首先将原始counts转换成log2CPM（counts per million reads ），然后根据每个基因的log2CPM制作线性模型，并计算了残差，得到了平滑曲线，最后可以得到每个基因和样本的权重。
为了鉴定ChRCC特异性基因，作者在ChRCC和所有其他亚型之间进行了成对比较，基于FDR p<0.05，fold change≥2鉴定出1268个基因作为候选的ChRCC生物标记，随后根据它们的表达水平和重要性对其进行排名。FOXI1，LINC01187，RHCG和HEPACAM2基因排名最高（图1.C）。
然后作者还使用内部未公开发布的scRNA-seq数据集，检测了推测的肿瘤起源细胞——闰细胞中候选基因的表达，然后被注释为癌症特异性cancer specifific（即在给定的癌症亚型中表达，在任何肾单位中低表达/无表达）或谱系特异性lineage specifific（即在给定的癌症亚型和某些肾单位段中表达）。根据scRNA-seq数据，FOXI1，LINC01187，RHCG和HEPACAM2被注释为谱系特异性基因（图1.D）；KLK15，LRRTM1和LINC00588被注释为ChRCC癌症特异性基因（图1.E）。TCGA ChRCC病例中这些基因表达显著升高，而部分病例在最初组织学评估中被误诊为其他亚型，这证实了作者筛选得到的生物标志物的重要性（图1.F）。
KICH= ChRCC；KIRC= CCRCC；KIRP= PRCCDT=远端小管；PT=近端小管；LOH=髓襻；PC=主细胞；IC=闰细胞
图1.ChRCC癌症和谱系生物标志物的获取
根据正常肾脏组织的scRNA-seq数据，发现FOXI1和LINC01187仅在于闰细胞表达（图1.D），这观察到的染色结果是一致的（图2），从而验证了谱系特异性生物标志物。接下来，作者通过IHC评估了MCTP数据中心的197个样本的肾脏肿瘤队列中FOXI1和RHCG蛋白的表达，并通过RNA-ISH评估了相似队列中162个样本的LINC01187表达（图3-6）。
总的来说，在Classic ChRCC中，可以观察到原发和转移性肿瘤中均有FOXI1、RHCG、LINC01187的高表达（图3）；在CCRCC中原发和转移性肿瘤中FOXI1、RHCG、LINC01187均为低/无表达（图4）；在双重RNA原位杂交中观察到FOXI1和LINC01187在classic ChRCC的共表达（图5.AB）以及在正常肾脏组织的闰细胞中表达（图5.CD）。而图6显示了FOXI1、RHCG、LINC01187在四处转移性ChRCC（网膜，右腰大肌，胃和腹膜后淋巴结）均有表达。
图2.正常肾脏中的生物标志物表达（A）正常肾组织（B）FOXI1（C）RHCG（D）LINC01187
图3.经典ChRCC （A）初级ChRCC（B）转移性ChRCC（CD）FOXI1核染色（EF）RHCG膜染色（GH）LINC01187
图4.透明细胞肾细胞癌CCRCC（A）初级CCRCC（B）转移性CCRCC（CD）FOXI1核染色（EF）RHCG膜染色（GH）LINC01187
2.细胞核转录因子FOXI1表达在ChRCC中富集
原发性和转移性ChRCC的FOXI1 IHC结果（图3CD）显示出弥漫性强阳性核染色，嗜酸细胞瘤和具有嗜酸性细胞特征的未分类RCC也显示FOXI1阳性染色。在HOT中，尤其是Birt-Hogg-Dubé综合征患者呈现出双重表型，因为只有一个肿瘤上皮细胞亚群呈现FOXI1阳性，导致了交错的染色模式（chekered pattern）。
为了进行比较，另外纳入了30例CCRCC，5例CCPRCC， 1例MTSCC和10例PRCC等样本进行评估。相反，其他亚型如：原发性（图4.AC）或转移性（图4.BD）CCRCC，CCPRCC，原发性或转移性PRCC，富马酸水合酶(FH)缺陷型肾癌，肾Bellini集合管癌（CDC）和MTSCC均无显示FOXI1染色。八个原发性t-RCC中有三个（37.5％）显示出弱FOXI1核染色；转移性t-RCC中染色为阴性。（表1）
表1.MCTP数据中心验证队列中FOXI1表达
3.RHCG膜表达在ChRCC中富集
在RHCG IHC结果中可以观察到这几种染色模式：圆周膜染色（补充图7A），杯口状染色（补充图7B）和高尔基样/分泌物染色（补充图7C）。
补充图7. RHCG染色模式
在原发性和转移性ChRCCs中发现强弥漫性圆周膜性RHCG染色（图3EF），而原发性和转移性CCRCCs为阴性（图4EF）。嗜酸性ChRCC显示高尔基样/分泌型或杯口状RHCG染色。所有嗜酸细胞瘤和低级具有嗜酸性细胞特征的未分类RCC表现出杯口状的RHCG染色。HOT中的RHCG染色情况如同FOXI1，出现交错染色模式。
原发性（图4E）或转移性（图4F）CCRCC，CCPRCC，原发性或转移性PRCC，FH缺失的RCC，CDC或MTSCC均未显示RHCG染色。一半的t-RCC表现为RHCG斑片状膜染色，结果与弱的FOXI1核染色一致，而转移性t-RCC为阴性。（表2）
表2. MCTP数据中心验证队列中验证队列中RHCG表达
4.LINC01187表达在ChRCC中富集
作者对167个RCC样本的组织切片进行了LINC01187的RNA-ISH，然后计算每个细胞的棕色点数目（每个点对应于单个RNA分子），并根据H评分来评估LINC01187的表达水平，H评分即RNAscope为0–4的细胞百分比的总和（[A％×0] + [B％×1] + [C％×2] + [D％ ×4] + [E％×4]，A + B + C + D + E = 100）。
RNAscope：0分=无染色或每10个细胞少于一个点；1分=每个细胞有1至3个点；2分=每个细胞有4至9个点，或cluster中很少点；3分=每个细胞有10–15点，或cluster中<10％点；4分=每个单元>15点，或cluster中>10％点。
在32个经典ChRCC（平均H评分= 371）和来自5个转移性ChRCC的18个位点（平均H评分= 368）中观察到LINC01187高的核表达水平。（图3GH），而原发性和转移性CCRCC（图4GH）显示无表达（H评分=0）。
8个嗜酸性ChRCC中有6个具有较高的LINC01187表达，具有嗜酸性细胞特征的未分类RCC和嗜酸细胞瘤也显示LINC01187高表达，提示这些肿瘤起源于共同的肾单位。HOT只有一个细胞群显示出LINC01187高表达，表现出交错染色。
而LINC01187在原发性CCRCC，CCPRCC，PRCC，t-RCC，CDC，或MTSCC均无表达（H得分= 0），所有转移性非ChRCC病例均显示LINC01187表达缺失（表3）。
FOXI1和LINC01187双重RNA-ISH染色显示FOXI1和LINC01187在大多数经典ChRCC肿瘤上皮细胞和相邻正常肾脏的闰细胞中共表达，这一结果支持了ChRCC起源于远端肾单位的观点。而且这些基因在正常细胞和癌细胞类型之间的核定位和选择性共表达模式表明这两个基因在转录上有调控作用，表明了可能由于谱系特异性FOXI1转录因子的丧失而导致的去分化状态。
表3. 验证队列中LINC01187表达
图5.FOXI1（红）和LINC01187（绿）双重RNA原位杂交 （AB）classic ChRCC（CD）正常肾组织的闰细胞
5.跨转移部位生物标志物的统一表达
最后，作者评估了5个患者的不同转移部位的18个转移性ChRCC中的FOXI1，RHCG和LINC01187表达。所有样品均表现出弥散性强FOXI1染色，圆周膜RHCG染色和LINC01187的高表达（H评分> 300）。图6显示了大网膜，右腰大肌，胃和腹膜后淋巴结转移的ChRCC样品中观察到的染色。这说明了FOXI1，RHCG蛋白和LINC01187转录本的统一的时空表达。
图6. 生物标志物在转移性ChRCC中的表达（A）HE染色（B）FOXI1（C）RHCG（D）LINC01187
6.生物标志物可鉴定与嗜酸性ChRCC形态学类似的亚型
在评估FOXI1，RHCG和LINC01187表达的过程中，作者观察到10例嗜酸性ChRCC中有2例表现出非常低的FOXI1核染色，RHCG表现出弥漫性高尔基样/分泌型染色，并且LINC01187表达呈阴性 。为了评估这两例是否只是和嗜酸性ChRCC的形态相似，而实际上代表不同的疾病亚型，作者对匹配的肿瘤和良性肾脏组织进行了全外显子组测序，以鉴定突变，拷贝数变异，以及进行RNAseq评价转录组突变。已知ChRCCs经常会有多个染色体有多次重复的单拷贝丢失（1、2、6、10、13 和17号染色体）。根据拷贝数变异分析，作者发现这些染色体都是正常的二倍体。值得一提的是，这两个样本均在MTOR基因的激酶结构域中存在热点错义激活突变（p.S2215Y，p.L2427Q）。作者从TCGA数据库中发现了另外三例最初被诊断为ChRCC或PRCC的病例，测序后被重新分类为具有MTOR激酶结构域突变的RCC，并且如作者所预期，它们缺少FOXI1和LINC01187表达。
小结
本篇研究中使用RNAseq数据筛选了区分RCC亚型的特异性生物标志物，然后在临床样本中进行了实验验证。证实了经典和嗜酸性ChRCC中FOXI1，RHCG和LINC01187的富集，这些生物标志物也可在嗜酸细胞瘤，HOT和具有嗜酸性细胞特征的未分类RCC中表达，但在CCRCC，PRCC，CCPRCC，CDC或MTSCC中不表达。
这项研究的优势包括使用了常见和罕见亚型的肾脏肿瘤的RNAseq数据，以及进行了多种亚型的大型组织验证。还用单细胞RNA-seq数据评估了肿瘤内异质性程度，证实筛选得到的基因在远端小管的闰细胞具有特异性表达。