Nature communications:染色体不稳定性的程度和部位决定了其致癌潜能
2020年3月20日荷兰乌得勒支市乌得勒支市昂科德研究所、胡布雷赫特研究所和大学医学中心Geert J.P.L. Kops & Nannette Jelluma 教授在Nature communications上发表Degree and site of chromosomal instability define its oncogenic potential。由于染色体不稳定(CIN)表型,大多数人类癌症是非整倍体。然而,尽管CIN和非整倍体是癌症的标志,但它们在肿瘤形成中的作用尚未明确地从动物实验中显现出来,因此仍不清楚。使用不同程度CIN的条件小鼠模型,作者发现特定范围足以驱动肠内非常早发的自发性腺瘤形成。在易患肠癌的小鼠(ApcMin)中,中度CIN可显著增加整个肠道的腺瘤负担,尤其是结肠远端的腺瘤负担,这与人类疾病相似。值得注意的是,高水平的CIN比中等水平的CIN更能促进远端结肠腺瘤的形成,但对小肠却没有影响。因此,作者的结果显示CIN可能具有潜在的致癌作用,但在不同的组织中,CIN的某些水平可能具有相反的作用。
染色体数目异常的非整倍体是人类肿瘤的特征。在胚胎发生过程中,几乎所有的非整倍体都是致命的,正常组织中的非整倍体水平很低,但70%-90%的实体瘤中观察到染色体畸变。非整倍体是染色体不稳定(CIN)的结果:有丝分裂过程中染色体偶尔增加或减少。CIN可导致基因组不稳定,并与肿瘤内基因组高度异质性、免疫逃避和促进转移有关。此外,CIN和非整倍体与肿瘤侵袭性、抗药性和患者预后不良相关。结直肠癌(CRC)是一种常见的恶性肿瘤,其CIN和非整倍体的发生率较高。结直肠癌分为遗传型和散发型,均以微卫星不稳定型(15%)和CIN(85%)肿瘤为主。CIN与患者预后不良相关:对63项共10126例CRC患者(60%的非整倍体肿瘤作为CIN的替代物)的荟萃分析显示,CIN肿瘤对5-氟尿嘧啶治疗的反应比非CIN肿瘤差,CIN患者的(无进展)生存率较低。尽管有上述相关性,CIN和非整倍体在肿瘤形成中的作用仍不清楚。CIN的小鼠模型偶尔显示出偶发的、自发的肿瘤,潜伏期很长(>12-18个月),并且主要在脾脏和肺,这表明CIN不是一个有效的癌症驱动因素。在易患癌症的小鼠中,CIN要么是中性的,促进肿瘤形成,要么在某些情况下抑制肿瘤形成。然而,由于使用不同的致癌背景、所检测组织的差异以及组织暴露于CIN的方式和时间,这些研究之间的比较非常困难。此外,由于技术上的限制,通常无法直接测量相关组织中的CIN,并且不同模型中的致癌作用不能归因于不同的CIN水平。因此,作者建立了一个基因小鼠模型,允许以组织特异性的方式控制诱导不同程度的CIN。利用这个模型,作者直接比较并发现不同程度的CIN对肿瘤形成的影响有显著差异:中到高的CIN水平足以驱动肠道肿瘤的早期形成,而中到高的CIN是最有效的。此外,在不同的组织中,类似的CIN水平驱动或促进肿瘤形成的能力并不相同。
图1:体内CIN分级增加的等位基因序列
活体中CIN分级升高的等位基因序列
为了实现CIN水平的组织特异性诱导,作者在纺锤体组装检查点激酶Mps1(图1a,b,)中创建了携带条件T649A(TA)或D637A(KD;kinase-dead)突变的小鼠菌株。人类细胞系中的类似突变分别导致轻度或重度CIN。作者推断,将这些Cre诱导的Mps1敲入(CiMKi)等位基因(与野生型Mps1结合)将导致CIN的等位基因序列,范围从非常低(很少失误,大多是轻微错误)到非常高(很多失误,大多是严重错误)。CiMKi小鼠出生时健康,符合孟德尔比例。通过向CiMKi小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)添加4-羟基三苯氧胺(4-OHT)激活Cre重组酶;Rosa26-CreERT2小鼠导致突变Mps1 mRNA的高效重组和表达,将突变的MPS1蛋白翻译成与野生型蛋白相当的水平。如预期的那样,等位基因序列导致MPS1活性分级下降。4-OHT处理的永生化MEFs的延时显微镜显示随着MPS1激酶活性的降低,有丝分裂错误显著增加(图1d),验证了等位基因序列的预测表型。对肠组织切片的后期图分析表明,CIN的预期范围被诱导成功(图1e)。此外,单细胞全基因组核型测序(scKaryo-seq)显示,在诱导中度、高度和极高CIN后一周,小肠内的非整倍体和核型异质性均增强(图1f)。因此,作者认为CiMKi小鼠模型能够在体内对一系列CIN进行时空控制。
图2:中度CIN引起肠内早期自发性肿瘤的发生
中度CIN可导致早期肠肿瘤的发生
CiMKi中的全身突变诱导;Rosa26-CreERT2小鼠扰乱小肠组织(图2a)。紊乱的程度与CIN的程度相关,可能解释了CIN高和非常高的小鼠出现的严重体重减轻。为了研究在不影响其他器官的情况下在肠道中早期诱导CIN,从性交后12.5天开始产生了CiMKi-Villin-Cre小鼠,以实现突变诱导。所有CiMKi-Villin-Cre小鼠均健康,正常生育,未出现腹泻、体重减轻等肠道功能障碍迹象,也未出现任何其他健康问题迹象,如姿势异常、不能活动或无反应。此外,作者在12周或8个月时没有观察到任何一般组织特征的异常,除了中度CIN组。此外,根据亚甲基蓝染色(图2b-d)判断,中度CIN在12周龄时已在这些小鼠的小肠中造成一个或多个损伤。通过组织学分析,作者证实这些小鼠确实发生了多种不同大小的低级别腺瘤(图2e)。这些腺瘤对核连环蛋白呈阳性,表明CIN足以诱导组成性Wnt途径活化(图2f)。此外,在中度CIN组中,作者在一只小鼠的结肠中发现了一个大型低级别腺瘤(图2g)。为了进一步了解不同程度CIN对肿瘤发生的反应性差异,作者进一步分析了12周龄小鼠结肠和小肠组织的存活率和增殖活性的差异。作者发现在活隐窝的数量上(由每个隐窝中pHH3的阳性率确定)和增殖活性上没有显著差异。在结肠和小肠中,作者观察到每个隐窝的有丝分裂(pHH3阳性)细胞和每个隐窝的凋亡细胞(基于形态学)随CIN程度的增加而增加。然而,作者没有观察到中度到极高CIN之间的显著差异。因此,CIN可以导致很早的发病,自发的肿瘤发生。CIN的这种作用在不同程度的CIN之间是不同的,在中度CIN的小鼠中效果最强(图2c、d、g)。综上所述,这些数据表明不同的CIN水平对自发肠肿瘤的发生有不同的影响。术后一般组织特征检查然而,CIN诱导并没有对此提供明显的解释。
图3:CIN在肿瘤易感肠中的致癌潜能
程度和部位决定了CIN的致癌潜能
人类结直肠癌(CRCs)常为非整倍体,其中绝大多数是由Wnt途径成分(如APC47-C49)基因的功能突变引起的。此外,APC杂合子丢失可导致家族性腺瘤性大肠息肉病(FAP)综合征患者中广泛的息肉生长。为了研究CIN对易患癌症的组织的影响,作者接下来研究了携带突变Apc等位基因(ApcMin)的CiMKi小鼠。ApcMin小鼠通常在小肠中约30个腺瘤,结肠中没有或很少。与CiMKi-Villin-Cre小鼠相比,ApcMin背景(CiMKi-KD/KD;ApcMin/;Villin-Cre)中很高的CIN是胚胎致死性的,排除了对这一CIN水平的进一步分析。当30、36、54岁的小鼠在预期的12周内死亡时,中度或高度CIN的小鼠因体重下降而在6-8周内死亡。ApcMin中度CIN小鼠的小肠腺瘤数量显著增加(图3a-c)。然而,高CIN和低CIN都没有同样的作用,这表明小肠腺瘤的形成对狭窄的CIN范围是敏感的。对同一CiMKi;ApcMin-Villin-Cre小鼠结肠的宏观检查显示,与对照组和低CIN小鼠相比,中、高CIN小鼠结肠被大腺瘤广泛覆盖(图3d-f图3B)。这在结肠远端最为明显,在那里非整倍体APC突变肿瘤也最常见于人类。发病率为100%,并且在ApcMin背景中,腺瘤的数量明显高于其他CIN模型的报告。重要的是,从这些结肠腺瘤中建立的类器官中的CIN仍然与预期水平相对应(图3g),这表明高CIN水平并不是针对腺瘤形成后选择的,也不存在朝着“最佳”CIN水平的漂移。值得注意的是:虽然单个腺瘤的大小在所有诱导的CIN水平之间是可比的,但CIN水平中等或高的腺瘤在很大程度上更早达到这个大小。因此,作者假设CIN会提前启动,加速生长肿瘤,或两者兼而有之。在人类中,结肠远端的肿瘤通常被认为是CIN导致,因为它们是典型的非整倍体和核型不均一的。由于CiMKi-ApcMin-Villin-Cre中、高CIN小鼠模拟了这种远端结肠肿瘤状态,作者接下来评估了结肠腺瘤的非整倍体和拷贝数改变(CNAs)的异质性。结果显示,随着CIN的升高,非整倍体和核型异质性增加(图3g,h)。18号染色体含有Apc等位基因(在人类FAP肿瘤中经常受到LOH的影响),在绝大多数细胞中是二倍体。由于ApcMin小鼠的腺瘤形成需要野生型Apc的LOH,并且由于CiMKi结肠腺瘤器官样体独立于Wnt配体生长,这表明CIN引起的Apc的LOH发生在整个18号染色体丢失之外,如之前所述。靶向PCR只检测到ApcMin等位基因,强烈提示LOH是由两条染色体18的双不分离事件或体细胞重组完成的,后者可能是FAP患者中APC-LOH的原因。这两个过程都可以被CIN加速。作者的数据表明,在相同的遗传背景下,CIN对染色体核型异质性和肿瘤形成的影响取决于CIN的程度和CIN发生的组织。由于高CIN可导致大量结肠腺瘤,但并未增加小肠腺瘤的形成,因此类似范围的CIN的作用可能有很大不同在组织之间。为了更好地了解组织对CIN的敏感性,作者首先评估了相同CiMKi突变导致小肠和结肠CIN水平不同的可能性。尽管结肠和小肠器官的延时成像显示两种组织之间的CIN水平不相同(在ApcMin背景下),但对肿瘤形成有显著不同影响的基因型(图3c,f)具有可比的CIN水平。
图4:促进结肠的增殖,但不促进小肠的增殖
例如,结肠中的CiMKi-TA/TA与小肠中的CiMKi-TA/KD)(图4a,b)。然而,值得注意的是,中度和高CIN导致CiMKi-ApcMin-Villin-Cre小鼠在4周龄时(大致是腺瘤发生的时间)结肠中的增殖间隔显著扩大,但小肠中没有(图4c-f)。各基因型间增殖细胞百分比(增殖指数)相似,因此隐窝中的增殖细胞总量增加(图4C,D)。所以,中、高CIN小鼠结肠中的细胞可能更容易保持增殖状态,增加了转化细胞在结肠隐窝中繁殖的机会。小肠中没有观察到这种增殖状态的增加,这也再次强调了这些组织之间CIN反应的差异。
总之,作者的研究意义在于利用CiMKi模型准确地研究CIN与肿瘤发展在组织和遗传背景中的相互作用。因为CiMKi对CIN的严格时空控制也使人们能够研究不同水平CIN对癌细胞扩散的影响,以及可能的肿瘤消退。后者可以极大地帮助正在进行的检查CIN是否恶化的工作,例如通过MPS1小分子抑制剂,是否有可能应用于癌症治疗?
原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-020-15279-9