病毒组的应用

噬菌体在自然环境中的意义在于它们能够在宿主体内复制，从而影响细菌群落的多样性，在人体内，噬菌体的作用是保护人体免受致病菌的侵袭；海水中含有4´10³⁰种病毒，这使其成为最大的噬菌体库；土壤噬菌体具有影响其养分循环及植物根系与细菌之间的共生关系的功能。在人工环境中，噬菌体介导细菌生长的能力可以被开发为多种用途，由于其特殊性导致它们可以轻易地被基因改造；在废水处理中，噬菌体可以用来影响现有的细菌群落，从而提高处理效率；在工业上，噬菌体的应用主要为控制食源性病原体和减少石油工业中问题细菌的数量(图1)。

图1 自然环境和人工环境中的噬菌体(Batinovic S, et al, 2019)

病毒组在农业领域的应用

最初，噬菌体疗法主要应用在医学领域，即对感染人类的相关致病细菌进行治疗。40至50年前，噬菌体疗法作为控制植物病原体的手段，在农业环境中被广泛探索。在这些试验中出现了两个主要问题: (1)病原菌产生的胞外多糖阻止了噬菌体的吸附，(2)菌株之间存在不同程度的敏感性。随着对病毒组学研究的深入，使用噬菌体疗法来控制植物性细菌病原体的生长已经被越来越多地探索。近年来，在土壤-植物(作物/蔬菜/果树)体系中引入“农业噬菌体疗法”(agricultural phage therapy)来灭活致病细菌的研究也得到了发展(图2)。显而易见，噬菌体疗法(也称为噬菌体生物防治)的一个优点便是减少了对病原体使用化学制剂，这避免了与环境污染、生态系统破坏和作物残留化学物质有关的问题。

图2 噬菌体疗法控制土壤-植物系统中的致病菌(Mao Ye, et al, 2019)

土壤“病”了，给农作物供应再多养分也没有意义，土壤微生态失衡被视为农业领域亟待解决的重要难题。青枯菌(Ralstonia solanacearum)是世界范围内最具有毁灭性的植物病原菌之一，由于其致死性和持久性强，并且具有广泛的宿主范围以及广阔的地理分布，受该菌侵袭的土壤经常发生作物减产，甚至绝收的情况，由此造成的经济损失不可估量。Akiko Fujiwara等研究发现溶解性噬菌体(FRSL1)对青枯菌具有生物防治作用(Akiko Fujiwara, et al, 2011)(图3)。

图3 通过噬菌体疗法控制青枯病(Akiko Fujiwara, et al, 2011)

当然，为了提高噬菌体在生物防治中的抗菌效果，必须深入了解噬菌体生态学以及各种环境下噬菌体与宿主之间复杂的相互作用。这些噬菌体及其宿主细菌的基因组信息将有助于了解噬菌体的特性、噬菌体与细菌相互作用的历史和分子机制。

病毒组在生态环境领域的应用

从大的方面来讲，环境病毒的生态功能主要有三方面(王光华， 2017)(1)调控寄主群落结构。众所周知，自然生态系统中有两种主要现象调控微生物群落结构，即从底向上(Bottom-up)和从上而下(Top-down)的两个生态过程(Lenoir L, et al, 2007 and Thomas WC, et al, 2013)。噬菌体调控细菌群落结构是一种经典的 Top-down 调控，虽然学术界意识到该调控作用的重要性，但目前对这一调控过程的研究还处于黑箱状态，已有的报道主要是针对特定噬菌体及其寄主的动态变化(Ashelford K E, et al, 2009)，尚缺乏群落水平的研究结果。 Allen(Allen B, et al, 2013)等人以茶提取物作为噬菌体抑制剂添加到阿拉斯加土壤中，发现添加茶提取物在显著降低土壤中噬菌体数量的同时，也增加了微生物生物量和土壤呼吸速率，但该文对细菌群落结构是否产生影响没有报道。(2)直接或间接参与元素地球化学循环。病毒的这种作用体现在它的感染率、致死率、病毒的周转时间以及其巨大病毒数量上。病毒感染在引起寄主细胞死亡裂解的同时，也促发寄主细胞营养元素释放到环境中去，进而促进了元素的生物化学循环，这种由病毒介导的食物链传递方式叫做 Viral loop。有报道指出，在海洋中由病毒推动的碳环量占该生态系统碳循环总量的 6%—26%(Weinbauer MG，2004)。但与此相对应的土壤病毒，特别是土壤噬菌体在多大程度上促进了元素循环还未见报道。(3)作为基因水平移动的媒介。这个功能不难理解，正是病毒与寄主的共进化推动了地球生物群落不断演替，形成了如此多样性的地球生态系统(Thingstad TF, et al, 1997)。

在调控寄主群落结构方面，通过噬菌体控制细菌宿主，并以此减缓耐抗生素细菌的繁殖，受到越来越多的关注。在与细菌共同进化了数十亿年之后，噬菌体拥有了独特的感染宿主的能力，这使其能够在对微生物群落的其他部分几乎没有影响的前提下，控制有问题的细菌。与抗生素或杀菌剂不同，噬菌体可以继续复制并感染目标细菌，因此，部分学者认为可将基于噬菌体的微生物控制应用领域扩展到生态环境保护，比如在废水处理时减缓废水处理厂(wastewater treatment Plants, WWTPs)中耐抗生素细菌(antibiotic-resistant bacteria, ARB)的扩散。通常分离的窄价(narrow-host-range)噬菌体的感染性在加入到活性污泥后就会迅速下降，而多价(broad-host-range)噬菌体在活性污泥的微观世界中增殖极快，特别是当与它们的其宿主一起加入时。Pedro等利用非致病性生产宿主(Pseudomonas putida)培养多价噬菌体(PER01和PER02)，并测试宿主噬菌体混合物在活性污泥微环境中抑制耐多药(耐内酰胺)大肠杆菌NDM-1的能力，此外，他们对窄价大肠杆菌噬菌体鸡尾酒(MER01和MER02)也进行了测试，以作为对照(图4)。研究发现在抑制耐抗生素细菌模型方面，多价噬菌体鸡尾酒(PER01和PER02)明显比窄价大肠杆菌鸡尾酒(MER01 and MER02)更有效。在实验中，β-耐乳糖大肠杆菌NDM-1的最初浓度为6.2±0.1 log10 CFU(菌落形成单位colony-forming units)/mL，5天后，经多价噬菌体鸡尾酒处理的NDM-1浓度显著降低至3.8±0.2 log10 CFU/mL，而大肠杆菌鸡尾酒处理后浓度为4.7±0.3 log10 CFU/mL。由于存在替代宿主，多价噬菌体能够达到更大的密度，以增加耐抗生素细菌感染的可能性。含有bla_NDM-1抗性基因且存活的大肠杆菌的比例(0.57±0.07)显著低于对照组(0.74±0.08)。因此，由非致病性宿主安全生产的多价噬菌体可以提供一种新的方法来控制废水处理厂中的耐抗生素细菌，并减缓相关耐药基因在环境中的繁殖和释放(图4)。

图4 Broad-host-range与Narrow-host-range对比(Pedro, et al, 2017)

不仅如此，Pedro等的研究结果表明，多价噬菌体可以特异性控制目标细菌，而对活性污泥的活性几乎没有影响(以耗氧量衡量)。重要的是，多价噬菌体可以利用多个宿主，因此可以避免在生产过程中需要利用病原性或难以培养的宿主。传统的窄价噬菌体必须使用细菌靶标来生产，这可能产生重大的安全问题。此外，由于多价噬菌体可以在良性宿主中产生，因此在使用前可能不需要从宿主中提纯它们(图5)，从而大大节省了资金和运营成本。

图5 传统噬菌体生物防治与多价噬菌体生物防治(Pedro, et al, 2017)

与任何抗菌剂一样，噬菌体必须达到足够的浓度(即必须达到适当的噬菌体与宿主的比例，也称为感染复数(multiplicity of infection, MOI)，才能确保有效的微生物控制。然而，废水中活性污泥组成非常复杂，在感染宿主之前，噬菌体可能会因吸附污泥絮凝体、悬浮颗粒和共生菌而被去除。此外，环境压力，如太阳辐射和极端温度、盐度和pH值，也可能减少噬菌体数量和阻碍感染。总的来说，噬菌体的效价是两个相反过程的结果：生产性感染后的噬菌体复制和各种应激源引起的噬菌体衰变，表明噬菌体在增殖和抑制废水处理厂(wastewater treatment Plants, WWTPs )耐抗生素细菌(antibiotic-resistant bacteria, ARB)方面的能力仍需增强，这对于减少耐抗生素细菌对环境的排放是极为重要的。

也有研究通过对比宿主特异性性噬菌体、噬菌体鸡尾酒和多价噬菌体三者对土壤中ARPB和ARGs的抑制效果。发现在各种噬菌体处理中，鸡尾酒噬菌体对土壤和胡萝卜组织中ARPB/ARG耗散作用最显著，其次是多价噬菌体和宿主特异性噬菌体处理，但是多价噬菌体在维持土壤和胡萝卜组织中微生物群落的生态功能方面优于鸡尾酒噬菌体处理(图6) (Ye Mao, et al, 2017)。

图6 多价噬菌体和噬菌体鸡尾酒对ARPB和ARGs的耗散效果及对土壤群落多样性影响

病毒组在医药领域的应用

噬菌体疗法指的是将噬菌体作为生物制剂来杀灭目标细菌。溶解性噬菌体开始感染宿主时，吸附在细菌宿主表面的特定受体上，这些受体可能位于革兰氏阳性或阴性细胞壁，以及多糖胶囊，甚至附属物如菌毛和鞭毛上。噬菌体和细菌受体之间的锁钥关系通常决定了病毒能够感染的宿主范围，具有特征性的噬菌体受体的数量也在不断增加。吸附后，病毒将其遗传物质释放到宿主体内，大多数与人类病原体相关的裂解噬菌体属于尾状病毒科和微病毒科，具有双链或单链DNA基因组(Lin DM, et al, 2017)。接下来，病毒接管细菌的复制机制，创造下一代噬菌体，复制持续到噬菌体编码的蛋白质被激活，以裂解细胞，有效地杀死宿主，并允许新合成的病毒逃逸，重新启动周期。尽管噬菌体不是活的有机体，但它们确实是动态的实体，而溶解周期是噬菌体疗法的基石。相比之下，抗生素是一种只能选择性破坏细菌某些生理过程(如蛋白质或细胞壁合成)的化学物质，和噬菌体的作用机制存在很大的差异(表1)。1915年和1917年噬菌体被发现后 (O’Flaherty S, et al, 2009)，即被提议用于治疗人类细菌感染。目前，已经证实了实验性噬菌体治疗由革兰氏阴性菌(包括铜绿假单胞菌，伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)所引起肺炎的有效性(O’Flaherty S, et al, 2009)，动物模型也证明噬菌体可以作为注射剂来治疗全身败血症感染，而应用噬菌体治疗人类局部感染也取得了成功的结果(Rhoads DD, et al, 2009 and Wright A)。随着其在治疗中补充或替代抗生素的潜力的推进，预计未来将有更多的临床试验和多样化的应用。

表1与抗生素治疗相比，噬菌体治疗的优点、缺点和相似性(Barr JJ, et al, 2019)

甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的呼吸道感染可发展为致命的全身感染，噬菌体疗法有望对这些严重感染有效。在利用噬菌体对严重败血症的葡萄球菌呼吸道感染进行治疗时发现，噬菌体S130的使用总体上降低了金黄色葡萄球菌密度，并且在不同组织(例如肝，脾，血和肺)中存在显著的噬菌体复制，实验小鼠感染后6小时腹腔注射噬菌体可减轻其感染的严重程度。在肺中，噬菌体裂解可能在没有生物分子抑制的情况下发生，因为在肺中检测到显着更高的噬菌体浓度。此外，在肺支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的噬菌体裂解实验中未观察到抑制作用。这些结果可能的解释为：金黄色葡萄球菌在小鼠模型的肺中分布不均匀，并且在肺组织的选择中存在取样偏差。而在一位左胫骨感染了XDR Acinetobacter baumannii 和 MDR Klebsiella pneumoniae的病例中，噬菌体和抗生素进行的联合治疗能有效对其症状进行控制(Ran N P，et al, 2009)。

人类刚刚开始扩展噬菌体的用途，尚存在一些技术上的困难(O’Flaherty S, et al, 2009 and Lu TK, et al, 2011)。例如，与将任何药剂配制成半固体剂型(如乳膏或软膏)，将噬菌体掺入转移载体中使得整个最终产品具有均匀性是非常重要的，这确保了药物的一致性。另一方面，与其他药物不同，噬菌体是依赖于其结构完整性的大型生物实体，它们的尾巴也有一定的生物功能。最近在欧洲的PhagoBurn临床试验( Jault P, et al, 2019)中观察到噬菌体结构完整性对于治疗应用是非常重要的，据报道，噬菌体治疗效果不佳，可能是由于在制备治疗敷料期间对病毒的物理损伤造成的(图7)。噬菌体给药导致某些受试者产生噬菌体中和抗体，可能也会使噬菌体治疗无法达到预期的效果。为了促进噬菌体疗法的多功能临床应用，噬菌体和噬菌体疗法的研究应旨在通过开发基于现代科学技术的下一代噬菌体疗法来克服技术障碍，在本书特别篇——噬菌体疗法中会进行详细分析。

图7肺源致死性败血症(感染)和未感染小鼠组织中的噬菌体浓度(Shigenobu Matsuzaki, et al,2014)

传统培养方法只能以已知的病毒为目标，很难发现新病毒，而宏病毒组的方法则结合了新一代测序技术以及随机PCR技术，能够挖掘大量未知病毒， 而且不需要分离培养，这为部分高分散、低丰度的病毒系统分析和鉴定提供了新的途径。我国拥有十分丰富的生物资源，在病毒领域的挖掘潜力极大，这对于我国的宏病毒组学研究是一种得天独厚的优势，研究人员借助宏病毒组学的方法已成功地从不同环境样本（人体、自然及人工环境）中鉴定出了多种病毒，这使人们了解到不同的病毒构成及其中间宿主的病毒携带状况，不仅丰富了病毒库，同时也增加了人们对病毒分布以及多样性的认识，进而更能有效地防治病毒的侵袭。此外，利用宏病毒组实时去监控致病性病毒及潜在致病病毒的变化情况，有助于分析新的或尚不明病原体的疾病，对快速检验突发的病毒性公共卫生事件意义重大。

未来在病毒组学方面，宏病毒基因组学将成为强力工具。目前，环境中病毒功能探索仅仅局限于序列筛选。但随着测序技术等新技术的发展，宏病毒组学足以更广泛和精确地应用在病毒相关领域。总之，宏病毒组学的发展必将突破传统技术瓶颈，在未来展现其的优势。

参考文献

Allen B, Willner D, Oechel W C, et al. Top-down control of microbial activity and biomass in an Arctic soil ecosystem. Environmental Microbiology, 2009, 12(3): 642-648.

Ashelford KE, Fry J C, Bailey M J, et al. Characterization of six bacteriophages of Serratia liquefaciens CP6 isolated from sugar beet phytosphere. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(5): 1959-1965.

Batinovic S, Wassef F, Knowler SA, et al. Bacteriophages in Natural and Artificial Environments[J]. Pathogens. 2019,8(3).

Fujiwara A, Fujisawa M, Hamasaki R, et al. Biocontrol of Ralstonia solanacearum by treatment with lytic bacteriophages[J]. Appl Environ Microbiol. 2011 Jun;77(12):4155-62.

Gordillo Altamirano FL, Barr JJ. Phage Therapy in the Postantibiotic Era. Clin Microbiol Rev. 2019 Apr;32(2) pii: 32/2/e00066-18.

Jault P, Leclerc T, Jennes S, et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): A randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infect. Dis. 2019, 19, 35–45.

Lenoir L, Persson T, Bengtsson J, et al. Bottom–up or top–down control in forest soil microcosms? Effects of soil fauna on fungal biomass and C/N mineralization. Biology and Fertility of Soils, 2007, 43(3): 281-294.

Lin DM, Koskella B, Lin HC. 2017. Phage therapy: an alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World J Gastrointest Pharmacol Ther 8:162-173.

Lu TK, Koeris MS. The next generation of bacteriophage therapy. Curr Opin Microbiol 2011; 14: 524e31.

Matsuzaki S, Uchiyama J, Takemura-Uchiyama I, Daibata M. Perspective: The age of the phage. Nature. 2014 May 1;509(7498):S9. pii: 509S9a.

O’Flaherty S, Ross RP, Coffey A. Bacteriophage and their lysins for elimination of infectious bacteria[J]. FEMS Microbiol Rev 2009; 33:801e19

Ran NP, Daniel G, Ayman K, et al. Successful Treatment of Antibiotic-resistant, Poly-microbial Bone Infection With Bacteriophages and Antibiotics Combination[J]. Clinical Infectious Diseases, 2019(11):11.

Rhoads DD, Wolcott RD, Kuskowski MA, Wolcott BM, Ward LS, Sulakvelidze A. Bacteriophage therapy of venous leg ulcers in humans: results of a phase I safety trial. J Wound Care 2009; 18:237e43

Thomas W C, David W G S, Stephen M T, et al. Top-down control of soil fungal community composition by a globally distributed keystone consumer. Ecology, 2013, 94(11): 2518-2528.

Thingstad TF, Lignell R. Theoretical models for the control of bacterial growth rate, abundance, diversity and carbon demand. Aquatic Microbial Ecology, 1997, 13(1): 19-27.

Ye Mao, Sun Mingming, Huang Dan, et al. A review of bacteriophage therapy for pathogenic bacteria inactivation in the soil environment. Environment International, 2019, 129: 488-496.

Yu P, Mathieu J, Yang Y, Alvarez PJJ. Suppression of Enteric Bacteria by Bacteriophages: Importance of Phage Polyvalence in the Presence of Soil Bacteria[J]. Environ Sci Technol. 2017 May 2;51(9):5270-5278.

Wright A, Hawkins CH, Anggard EE, Harper DR. A controlled clinical trial of a therapeutic bacteriophage preparation in chronic otitis due to antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa; a preliminary report of efficiency. Clin Otolaryngol 2009; 34: 349e57.

Weinbauer MG. Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiology Reviews, 2004, 28(2), 127-181.

王光华.掀开土壤生物“暗物质”——土壤病毒的神秘面纱[J].中国科学院院刊,2017,32(06):575-584