一作解读|小麦-簇毛麦#4易位系Pm97033中抗白粉病基因的筛选和功能鉴定
小麦白粉病（Blumeria graminis f.sp. tritici, Bgt）是危害小麦生产的主要病害之一，培育和利用抗病品种是防治小麦白粉病的经济、有效途径。到目前为止，从小麦及其近缘物种中共鉴定了106个白粉病抗性基因，其中仅克隆了Pm2、Pm3、Pm5e、Pm8、Pm21、Pm24、Pm41和Pm60 等（Cao et al. 2011; Hurni et al. 2013; Yahiaoui et al. 2004; Sanchez-Martin et al. 2016; He et al. 2018; Xing et al. 2018; Zou et al. 2018; Chen et al. 2019; Lu et al. 2020; Xie et al. 2020; Li et al. 2020）。簇毛麦是小麦的一个重要野生近缘种属，具有许多优良特性（包括高抗白粉菌），是小麦遗传改良的优良基因库。簇毛麦来源比较多，其中的簇毛麦#1-#5最受研究者关注。业已从簇毛麦中鉴定了CMPG1-V、PDI-V、LecRK-V、ERF1-V、Stpk-V、Pm55、Pm62、PmV 和Pm21等基因。尤其是，南京农业大学曹爱忠团队，江苏大学何华纲团队、江苏里下河地区农业科学研究所别同德团队利用图位克隆方法，从簇毛麦6V#2及其T6V#4S·6AL易位系中成功克隆了Pm21基因，表明该基因编码一个典型的CC-NBS-LRR蛋白。
为了挖掘簇毛麦#4中的白粉病抗性基因，我们对小麦-簇毛麦T6V#4S·6DL小麦抗病易位系Pm97033和感病亲本宛7107（W7107）接种白粉病菌0、12、24和48h后的叶片进行了转录组测序。在Pm97033 vs W7107有参部分，0 h时共有2830个差异基因，12h时共有3990个差异基因，24h时共有2568个差异基因，48h时共有6688个差异基因；12、24和48h之间有1718个共有基因，GO注释发现生物过程中最显著富集的是蛋白磷酸化，分子功能中最显著富集的是蛋白激酶活性。KEGG注释发现苯丙醇生物合成是最显著富集的通路，其次是苯丙氨酸代谢、次生代谢合成、植物-病原菌互作和乙醛酸和二羧酸酯代谢等；1718个共有基因中有890个为新基因，8个与抗病相关基因在Pm97033中特异表达，基因功能主要涉及抗病蛋白、半胱氨酸类受体蛋白激酶和细胞壁连接受体激酶。在Pm97033 vs W7107无参部分，0 h时共有46个差异基因，12h时共有1236个差异基因，24h时共有410个差异基因，48h时共有1137个差异基因；12和48h之间共有基因566个。P12 vs W12和P48 vs W48一起共有抗病相关基因22个，其中，c112345_g2和c112345_g3注释到Pm21，可能在Pm97033对白粉菌的抗病过程中起重要作用。
筛选到35个位于6V#4S染色体上的unigene序列，其中15个是与抗病相关的基因，利用qRT-PCR分析发现其中7个受白粉菌诱导上调表达。并分析了35个unigene在小麦6A、6B、6D和大麦6H上的共线性关系，发现大部分unigene在小麦6群和大麦6H短臂上具有较好的共线性。又利用其中25个unigene对W7107、Pm97033、簇毛麦#4、10SR3109和簇毛麦#2等材料进行扩增，将这些unigene分为了3种类型：（1）在簇毛麦#2和#4中具有一致扩增条带；（2）在簇毛麦#2和#4中具有不同大小扩增条带；（3）在簇毛麦#4中有特异条带，而簇毛麦#2中无此特异条带。
进一步利用BSMV-VIGS、转基因和基因编辑技术对4个基因DvLox、DvFbx、Pm21#4 和Pm21#4-H 进行了功能验证。DvLox、DvFbx 和Pm21#4 在Pm97033中沉默之后均影响了其对白粉菌的抗性。DvLox 和DvFbx 分别编码脂氧合酶和F-box家族蛋白，属于防卫基因，可能在抗病过程中起作用。过表达DvLox 的小麦植株对白粉菌具有一定抗性，但抗性提高不显著。Pm21#4 编码1个CC-NB-LRR抗病蛋白，可能在Pm97033对白粉菌的抗病过程中起关键作用。过表达Pm21#4 的小麦植株对白粉菌混合菌种表现免疫（图1），编辑Pm21#4 后的沉默小麦植株对白粉菌混合菌种高感（图2）。Pm21#4 和Pm21#4-H 都编码CC-NB-LRR抗病蛋白，但Pm21#4-H 在Pm97033中不受白粉菌诱导表达，过表达Pm21#4-H 基因的转基因小麦植株对白粉菌混合菌种表现免疫（图3）。
