一作解读|利用部分同源配对基因ph1b实现抗白粉病基因Pm6精细定位

小麦近缘属种蕴藏大量的优异基因，可以丰富小麦的遗传多样性，是小麦改良的重要基础。已正式命名的抗小麦白粉病基因中，多个基因都来自于小麦野生近缘物种，包括Pm6（提莫菲维小麦）、Pm8和Pm20（黑麦）、Pm21（簇毛麦）等。在对位于来自外源染色体区段的基因进行精细定位时，由于小麦与其近缘属部分同源染色体之间存在重组抑制，重组频率低，缩小定位的目标区间难。小麦中存在包括同源染色体配对 (Ph)基因在内的控制系统，通过Ph缺失或突变可以在一定程度上克服部分同源染色体间的重组抑制。包括ph1b，ph1c和ph2a和来自山羊草的PhI等都可以提高部分同源染色体间的重组频率，其中以位于5BL的ph1b效应最强。很多研究者利用中国春的ph1b突变体诱导小麦与外源染色体间的易位，从而将外源染色体片段导入到小麦背景中。

本实验室在上世纪90年代自瑞典引进了携带抗白粉病基因Pm6的一套渐渗系，Tao et al. (2000)和Ji et al. (2006)等人先后利用分子标记确定这些渐渗系中提莫菲维小麦2GL渐渗片段大小，遗传定位Pm6基因。Qin et al. (2013)和Chen et al. (2016)等人将Pm6精细定位于标记CINAU123和CINAU127之间，并在该区段克隆了两个TaLRR-RLK基因，转基因发现TaLRR-RLKs在抗白粉病中发挥正向调控作用。但我们在后续研究中排除了该基因为Pm6的候选基因。由于渐渗系中2G区段与小麦2B染色体间的重组抑制，阻碍了Pm6区间的进一步缩小。

本研究创建了“引入中国春ph1b突变体（CSph1b）- 连续多轮重组体筛选-两侧标记重组体分型”的精细定位策略。将CSph1b与携有Pm6的小麦-提莫菲维小麦渐渗系IGV1-465（图2）杂交、回交，在BC1F1中筛选Pm6位点杂合、ph1b位点纯合的单株（基因型为Pm6 pm6 ph1b ph1b），自交构建分离群体（图1)，利用两侧标记进行第一轮重组单株的筛选，结合重组单株的抗病表型缩小Pm6的定位区间；然后在群体中继续选择基因型为Pm6 pm6 ph1b ph1b的单株自交，利用两侧标记进行第二轮重组单株筛选；以此类推…。最终从1462个单株中筛选到182个重组单株，结合白粉菌生理小种E26的接种鉴定抗性表型，将Pm6定位区间从37Mb缩小至0.9Mb（图2）。

图1. Pm6精细定位群体的构建和连续多轮重组体筛选策略

图2. Pm6的精细定位

我们比较了作图群体中引入ph1前后目标区段重组频率。Qin et al.（2011）等利用小麦-提莫菲维小麦渐渗系IGV1-465（渐渗区段最小）与Prins（Ph1b Ph1b）构建的次级分离群体中，未能鉴定到目标区域重组；在小麦-提莫菲维小麦渐渗系IGV1-466（携带最大的2G渐渗区段）与Prins（Ph1b Ph1b）构建的次级分离群体中，目标区间的重组率为0.67%，平均每1Mb的重组率为0.005%。本研究利用IGV1-465与CSph1b构建的次级分离群体中，在BC1F2:3代中目标区间的重组率为20%，对应每1Mb的重组率为0.54%，在BC1F2:4代中的重组率为2.8%，对应每1Mb的重组率为0.28%。由此可见，在作图群体中引入ph1b可以大大提高部分同源染色体间的重组，实现了对外源目标基因的精细定位。

近期有研究报道，栽培小麦基因组中存在大量的外源渐渗区段（Cheng et al., 2019），因此本研究策略可用于定位于这些区域的基因的精细定位。需要指出的是，提莫菲维小麦G基因组与普通小麦的B基因组在进化上的亲缘关系比较近，在本研究中可以通过引入ph1b提高重组率，实现精细定位。对于其它的外源基因组，是否也能达到同样的效果有待验证。此外，目标基因在染色体上的位置（如是否位于着丝粒区域）也有可能影响ph1b的效果。

2020年1月23日Theoretical and Applied Genetics杂志在线发表了王秀娥研究团队这一研究成果(DOI: 10.1007/s00122-020-03546-8)。王秀娥研究组万文涛博士和肖进副教授为该论文的共同第一作者，南京农业大学王秀娥教授和王海燕教授为该论文的共同通讯作者。该项研究得到国家自然科学基金、国家重点研发专项等项目资助。

参考文章：

Wan, W., Xiao, J., Li, M. et al. Fine mapping of wheat powdery mildew resistance gene Pm6 using 2B/2G homoeologous recombinants induced by the ph1b mutant. Theor Appl Genet (2020). https://doi.org/10.1007/s00122-020-03546-8

Cheng, H., Liu, J., Wen, J. et al. Frequent intra- and inter-species introgression shapes the landscape of genetic variation in bread wheat. Genome Biol 20, 136 (2019). https://doi.org/10.1186/s13059-019-1744-x

Chen, T., Xiao, J., Xu, J. et al. Two members of TaRLK family confer powdery mildew resistance in common wheat. BMC Plant Biol 16, 27 (2016). https://doi.org/10.1186/s12870-016-0713-8

Qin, B., Cao, A., Wang, H. et al. Collinearity-based marker mining for the fine mapping of Pm6, a powdery mildew resistance gene in wheat. Theor Appl Genet 123, 207–218 (2011). https://doi.org/10.1007/s00122-011-1577-9

Ji, J., Qin, B., Wang, H. et al. STS markers for powdery mildew resistance gene Pm6 in wheat. Euphytica 163, 159–165 (2008). https://doi.org/10.1007/s00122-011-1577-9

Tao, W., Liu, D., Liu, J. et al. Genetic mapping of the powdery mildew resistance gene Pm6 in wheat by RFLP analysis. Theor Appl Genet 100, 564–568 (2000). https://doi.org/10.1007/s00122-011-1577-9