一种组合药物在淋巴瘤的应用.pdf / 开普饭

10)申请公布号 CN 103191406 A (43)申请公布日 2013.07.10 CN 103191406 A *CN103191406A* (21)申请号 201310124787.8 (22)申请日 2013.04.11 A61K 38/05(2006.01) A61K 36/71(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 31/69(2006.01) (71)申请人太仓市胜舟生物技术有限公司地址 215434 江苏省苏州市太仓市浮桥镇镇中路 20 幢 151 室 (72)发明人夏飞 (74)专利代理机构上海卓阳知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 31262 代理人金重庆 (54) 发明名称一种组合药物在淋巴瘤的应用 (57) 摘要本发明涉及一种组合药物在制备治疗淋巴瘤疾病药中的应用，所述的组合药物由西药和中药药物组成，所述的西药是硼替佐咪，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成：苦参 5-15 份、玄参5-10份、丹皮10-20份，所述的淋巴瘤是T细胞淋巴瘤。本发明优点在于：通过使用本发明的组合药物，发挥组合药物的协同作用，可以协同抑制T淋巴瘤细胞生长增殖，协同诱导T淋巴瘤细胞凋亡。药物组合在提高疗效的同时下可大幅降低费用，降低副作用。使用本发明的组合药物可以克服现有技术中单独使用一种药物引起耐药的缺点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图4页 (10)申请公布号 CN 103191406 A CN 103191406 A *CN103191406A* 1/1 页 2 1. 一种组合药物在制备治疗淋巴瘤疾病药中的应用，所述的组合药物由西药和中药药物组成，其特征在于，所述的西药是硼替佐咪，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成：苦参 5-15 份、玄参 5-10 份、丹皮 10-20 份，所述的淋巴瘤是 T 细胞淋巴瘤。 2. 根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成：苦参 8-12 份、玄参 6-9 份、丹皮 12-18 份。 3. 根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成：苦参 10 份、玄参 7 份、丹皮 15 份。 4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的硼替佐咪和中药药物比例为5-100 nM ： 1-30g/ml。 5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的硼替佐咪和中药药物比例为25nM ： 20g/ml。权利要求书 CN 103191406 A 2 1/4 页 3 一种组合药物在淋巴瘤的应用技术领域 0001 本发明涉及一种药物应用，具体地说，是关于一种组合药物在淋巴瘤的应用。背景技术 0002 T 细胞白血病 / 淋巴瘤之产生，与一种反转录病毒 HTLV-1 之感染有关。临床上患有成人T-细胞白血病/淋巴瘤的病患会出现淋巴腺肿大、肝脾肿大、皮肤病症如红斑、骨骼溶蚀性病症、及高钙血症等症状。病患之周边血液内也可能会出与典型之细胞核呈花瓣状之 T- 淋巴球。病患罹病后对感染之抵抗力会降低，因此容易得到伺机性病原菌之感染。此病预后甚差，无论以何种化疗组合其缓解期均十分短暂，且大部分病人于诊断确立后十二个月内死亡，平均存活期不到一年（急性期的病患约为五个月，而淋巴瘤型者约为十个月）。 0003 中国专利文献 CN ： 101732329A，公开了一种具有协同作用的治疗 T 细胞淋巴瘤的组合药物及其应用，但是关于治疗淋巴瘤的西药和中药的组合是否能够协同治疗肿瘤的，是否能在治疗肿瘤疾病中的应用，目前还未见报道。发明内容 0004 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种组合药物在制备治疗淋巴瘤疾病药中的应用。 0005 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种组合药物在制备治疗淋巴瘤疾病药中的应用，所述的组合药物由西药和中药药物组成，所述的西药是硼替佐咪，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成：苦参5-15份、玄参5-10份、丹皮10-20份，所述的淋巴瘤是 T 细胞淋巴瘤。 0006 所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成：苦参 8-12 份、玄参 6-9 份、丹皮 12-18 份。 0007 所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成：苦参10份、玄参7份、丹皮15份。 0008 所述的硼替佐咪和中药药物比例为 5-100nM ： 1-30mg/ml。 0009 所述的硼替佐咪和中药药物比例为 25nM ： 20mg/ml。 0010 本发明优点在于：通过使用本发明的组合药物，发挥组合药物的协同作用，可以协同抑制 T 淋巴瘤细胞生长增殖，协同诱导 T 淋巴瘤细胞凋亡。药物组合在提高疗效的同时下可大幅降低费用，降低副作用。使用本发明的组合药物可以克服现有技术中单独使用一种药物引起耐药的缺点。附图说明 0011 图 1 显示流式细胞仪检测 JURKAT 凋亡对照组的效果图。 0012 图 2 显示单用西药 JURKAT 凋亡的效果图。 0013 图 3 显示单用中药药物 JURKAT 凋亡的效果图。 0014 图 4 显示合用药物 JURKAT 凋亡的效果图。说明书 CN 103191406 A 3 2/4 页 4 0015 图 5 显示流式细胞仪检测 HUT78 凋亡对照组的效果图。 0016 图 6 显示单用西药 HUT78 凋亡的效果图。 0017 图 7 显示单用中药药物 HUT78 凋亡的效果图。 0018 图 8 显示合用药物 HUT78 凋亡的效果图。具体实施方式 0019 下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0020 实施例 1 中药药物制备 ( 一 ) 取中药苦参 100g、玄参 70g、丹皮 150g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（2 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（2 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 5mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0021 实施例 2 中药药物制备 ( 二 ) 取中药苦参 100g、玄参 70g、丹皮 150g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（1 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（2 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 1mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0022 实施例 3 中药药物制备 ( 三 ) 取中药苦参 100g、玄参 70g、丹皮 150g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（2 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（3 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 10mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0023 实施例 4 中药药物制备 ( 四 ) 取中药苦参 100g、玄参 70g、丹皮 150g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（3 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（4 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 20mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0024 实施例 5 中药药物制备 ( 五 ) 取中药苦参 100g、玄参 70g、丹皮 150g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（2 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（2 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 30mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0025 实施例 6 中药药物制备 ( 六 ) 取中药苦参 50g、玄参 100g、丹皮 100g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（3 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（4 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 20mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0026 实施例 7 中药药物制备 ( 七 ) 说明书 CN 103191406 A 4 3/4 页 5 取中药苦参 150g、玄参 50g、丹皮 200g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（3 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（4 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 20mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0027 实施例 8 中药药物制备 ( 八 ) 取中药苦参 80g、玄参 60g、丹皮 180g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（3 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（4 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 20mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0028 实施例 9 中药药物制备 ( 九 ) 取中药苦参 120g、玄参 60g、丹皮 120g 置煎煮容器内，加入 750 的冷水浸泡 1h，煮沸 30 min，过滤（3 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（4 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 20mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0029 实施例 10 中药药物制备 ( 十 ) 取中药苦参150g、玄参100g、丹皮200g置煎煮容器内，加入750的冷水浸泡1h，煮沸 30 min，过滤（3 次）。药渣加入 450 水继续煎煮，煮沸 20 min，过滤（4 次）。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材 20mg/ml 的药液，冷却装入灭菌药瓶，置 4冰箱备用。 0030 实施例 11 药效实验（一）试剂硼替佐咪，苦参、玄参、丹皮， ( 二 ) 细胞培养本研究应用了以下两种细胞株：人 T- 细胞性淋巴瘤细胞株 JURKAT 和 HUT78，细胞在 5%CO2-95% 空气，饱和湿度以及 37 C 的条件下，培养于 RPMI-1640 培养液中 (Gibco/BRL)，并加入 10% 胎牛血清。在每次实验中，细胞接种密度为 3105 /ml。细胞的存活率采用台盼兰拒染实验检测。细胞形态学观察采用瑞氏染色法。 0031 ( 三 )MTT 实验在96孔板中，用硼替佐咪终浓度选用0、 5、 10、 25、 50和100nM ，中药药物（苦参、玄参和丹皮）组终浓度选用 0、 1、 5、 10、 20 和 30mg/ml 处理细胞。0 剂量组用 1640 培养液代替。72 小时后，向每孔中加入 0.1 mg MTT，在 37下孵育 4 小时后，在分光光度计 570nm 处测量标本吸光度值。 0032 ( 四 ) 流式细胞仪检测 annexin-V 和线粒体跨膜电位：细胞凋亡用 ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit （BD）进行分析。在检测线粒体跨膜电位中，细胞用 PBS 洗后，在 37下与 10 mg/ml Rh123 孵育 30 分钟，然后再用 50 mg/ ml PI 染色。荧光强度用流式细胞仪进行测量。 0033 ( 五 ) 免疫印迹分析：用 200 ml Laemmli 裂解缓冲液 (0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 2mM EDTA, 10% glycerol, 2% SDS and 5% b-mercaptoethanol) 裂解 5x106细胞。蛋白裂解物 (20 mg) 用说明书 CN 103191406 A 5 4/4 页 6 于 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在溶于 TBS/0.05% Tween 20 的 5% 脱脂牛奶中封闭，之后与一抗在室温孵育 2 小时，与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育 1 小时。免疫复合物用辣根过氧化物酶化学发光检测试剂盒检测。 0034 ( 六 ) 核蛋白分离：每1107细胞与裂解缓冲液(10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, pH 7.9)洗后，重悬于提取缓冲液(20 mM HEPES, pH 7.9, 420 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.2 mM EDTA and 25%甘油)中，冰上孵育20分钟。 12000g离心10分钟后，上清即为核蛋白。 0035 ( 七 ) 统计分析：实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。 P值小于0.05 则认为具有统计学差异。所有的统计采用 SAS8.2 软件。 0036 （八）结果：采用 JURKAT， HUT78 细胞进行培养，通过分析观察硼替佐咪、中药药物组单独及联合应用对细胞生长增殖的影响。硼替佐咪（25nM）联合中药药物（20mg/ml）应用 48 小时可显著抑制 JURKAT， HUT78 细胞的增殖。 0037 用流式细胞仪检测单用及合用药后细胞的凋亡（Annexin V 和 PI 双染法）。 0038 JURKAT（细胞株 1）经硼替佐咪（25 nM）、中药药物（20mg/ml）及硼替佐咪（25 nM）联合中药药物（20mg/ml）处理的 48 小时后 , Annexin V 阳性细胞分别为：对照组 3.4 （见图 1）；硼替佐咪组 17.3（见图 2）；中药药物组 7.3（见图 3）；硼替佐咪与中药药物合用组 36.7（见图 4）。 0039 在 HUT78（细胞株 2）：对照组 3.0（见图 5）；硼替佐咪组 4.2（见图 6）；中药药物组 6.4（见图 7）；硼替佐咪与中药药物合用组 32.7（见图 8）。 0040 同时我们应用 Berenbaum 建立的等效应线图法分析硼替佐咪与中药药物的联合应用是协同、相加或拮抗。说明书 CN 103191406 A 6 1/4 页 7 图 1 图 2 说明书附图 CN 103191406 A 7 2/4 页 8 图 3 图 4 说明书附图 CN 103191406 A 8 3/4 页 9 图 5 图 6 说明书附图 CN 103191406 A 9 4/4 页 10 图 7 图 8 说明书附图 CN 103191406 A 10

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