科研│PLANT PHYSIOL（IF：6.902）：互叶梅雄性配子体功能的转录和蛋白质组学研究
编译：微科盟秦时明月，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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开花植物(被子植物)的特征是花粉管(PTs雄配子体)携带着两个稳定的精子细胞，这两个精子细胞通过心皮长向胚珠，在胚珠上进行双受精。目前尚不清楚这些生殖结构是如何进化的，哪些基因在被子植物的雄配子体中从头发生，以及被子植物之间PT功能的保守程度。为了更深入地理解配子体功能的进化，研究人员从互叶梅（又名无油樟）7个生殖组织和2个营养控制组织中得到了转录组测序数据以及花粉粒(PGs)和PTs的蛋白质组数据。利用双子叶模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为数据分析的参考，因为该物种中有200多个基因与雄配子体功能相关。研究人员收集双细胞互叶梅原球茎，体外诱导其萌发，并监测原球茎生长和生殖细胞分裂。转录组学和蛋白质组学分析表明，互叶梅植物PGs需要脂类、能量为萌发做准备，但也可能需要活性氧，而PTs的特征是分解代谢/生物合成和转运过程，包括细胞壁生物合成和基因调节。拟南芥中缺乏许多花粉特异性基因，并且在互叶梅中参与花粉信号传递的基因数量显著减少。总之，本研究提出了对被子植物雄配子体功能的见解，并为开花植物进化的研究提供了有价值的资源。
论文ID
原名：Transcriptomic and Proteomic Insights into Amborella trichopoda Male Gametophyte Functions
译名：互叶梅雄性配子体功能的转录和蛋白质组学研究
期刊：Plant Physiology
IF：6.902
发表时间：2020年12月
通讯作者：Thomas Dresselhaus
通讯作者单位：德国雷根斯堡大学细胞生物学和植物生物化学研究所
DOI号：10.1104/pp.20.00837
实验设计
结果
1 互叶梅花粉在体外PT生长的14小时内产生两个精细胞
研究人员连续四年在开花期从雌雄植物上的雌雄花中收集PG和胚珠，并从雄植物中收集营养植物材料。为了研究互叶梅的PGs和PTs(代表雄配子体)，研究人员首先建立了大量分离的成熟PGs并在体外诱导其萌发的方案。尽管互叶梅的花很小(图1，A和B)，使用图1E中描述的方法成功的从花药中大量收获成熟的PGs(图1，C和D)。在一个50毫升的试管中收集20朵雄花，加入25毫升山茶花花粉萌发培养基CJ-PGM，并将试管涡旋45秒以将PGs释放到溶液中。之后，悬浮液首先通过1毫米孔径的筛网过滤以去除大的碎片，然后通过70、30和15微米孔径的过滤器过滤以去除小的碎片并分离研究人员在所有PG制剂中发现的污染真菌孢子 (图1D)。
为了诱导离体花粉萌发，测试了五种不同的植物生长调节剂(补充表S1)，并在培养10小时后评估萌发率。使用液体CJ-PGM观察到最大发芽率(83.17%)(图2A)。研究人员接下来确定互叶梅花粉管在固体CJ-PGM上的生长率为100.46±6±0.5 (图2B)，显示互叶梅的PT生长在体外是线性的 (图2C)。
研究人员分析了PGs和PTs的细胞核含量和细胞壁物质。4，6-二氨基-苯基吲哚（DAPI）染色证实互叶梅产生包括单个生殖细胞(GC)和管状细胞的双细胞PGs，与GC相比，管状细胞的营养核含有较少的紧密染色质(图3A)。通过钌红染色来研究果胶在PGs和PTs细胞壁中的含量和位置。果胶含量最高的部位在PG的开口区和PTs的顶端，但在整个PT的茎部也存在(图3B)。苯胺蓝染色显示在细胞壁中存在愈伤质沉积，并且在生长过程中形成延伸的愈伤质栓塞(图3，C和D)。PTs顶端完全没有愈伤质，显示出强烈的染色反应。营养核和GC在PG萌发和PT生长期间保持联系，营养核向前移动(图3E)。萌发后14小时，GC的分裂产生两个精细胞(图3F)。SYBR GREEN I染色结合膜计数染色显示，在PT中精子细胞的平均长度为10毫米。与GC和营养管细胞的染色质相比，精子细胞的染色质高度浓缩(图3G)。在CJ-PGM上孵育14小时后，约90%萌发的PTs是三细胞期的。该时间点用于在三细胞期阶段对PTs进行采样，以供进一步实验。
图1. 互叶梅的生殖器官和PG分离程序。A一种成熟的雌花，由五到六个心皮组成。B 成熟的雄花显示10到25个花药。C和D，切开的花药(C)和成熟花粉囊(D)。E PG分离过程的示意图。
图2. 互叶梅体外花粉萌发和花粉囊生长。A 固体CJ-PGM上的离体花粉萌发。B 在固体培养基上监测生长发芽15至34分钟的植物。
图3. 互叶梅的PG和PT特征。A 一个成熟的双细胞PG的DAPI染色和它的明场图像。B 成熟PG和PT尖端的钌红染色。C和D，PTs的苯胺蓝染色和各自的明场图像。E 体外萌发9小时后的PG显示具有营养核的PT和GC。F 离体萌发后14小时，出现营养核，随后出现两个精子。G 体外萌发14小时后，SYBR GREEN I染色的PT更详细地显示了雄性生殖单位。
2 互叶梅雄配子体在不同时期的转录组高度相似，表现出较低的动态
为了观察花粉萌发前和萌发过程中基因表达的差异，研究人员分析了互叶梅成熟花粉粒以及双细胞期和三细胞期的PTs的转录组。总共从PGs产生了4660万个reads，从PT-Bi产生了6388万个reads，从PT-Tri阶段产生了5801万个reads，并且映射到互叶梅基因组，包含27313个预测基因。此外，从互叶梅的胚珠、叶子、雌雄花、花被和根中产生转录组数据，分别产生8.91、22.55、80.25、81.96、50.17和1860万个reads。表1展示了从所有这些组织获得的转录组数据。在组织比较中选择具有高、中和低log2FC值的9个基因，并通过RT-qPCR验证了这些基因的转录组结果。
为了确定在PGs、PT-Bi和PT-Tri中表达的基因数量，研究人员首先规定表达量TPM≥1的基因才能被用来分析。维恩图分析显示，在PG、PT-Bi和PT-Tri样品的生物重复中，分别有90.0%、93.1%和89.4%的重叠(图4A)。除了胚珠样品显示生物重复之间只有45.3%的重叠，在所有样品中只有6144个表达基因，但是其他对照样品(叶、根、花和花被)显示84.4%至91.9%的重叠，平均有15000个表达基因(图4B)。研究人员假设，三个胚珠样本之间的较低重叠导致所有样本中存在的基因数量较低，这是由于在稍微不同的发育阶段进行组织收集的结果。在所有PG样品中共有10134个基因表达，而PT-Bi共有10384个基因表达，PT-Tri有11002个基因表达。此外，主成分分析展示了生物重复之间以及三个花粉发育阶段和对照组织之间的相似性。如图4C所示，除了PT-Tri阶段(在PT-Bi阶段仍含有约10%的PTs)，所有生物重复都紧密地聚集在一起，三个雄配子体阶段彼此差异很大。对所有九个样本(包括叶、根、花、花被和子房)的主成分分析显示，三个雄配子体阶段非常紧密地组合在一起(图4D)。总之，生物重复之间的高度重叠和多囊胚珠中不同明显可分离亚组的存在强调了不同样品之间的高度可重复性，并表明互叶梅雄配子体在不同发育阶段的转录组高度相似。
接下来，研究人员旨在确定PGs、PT-Bi和PT-Tri之间的差异表达基因（DEG）。为此，研究人员使用DESeq2程序比较了PGs与PT-Bi、PGs与PT-Tri、PT-Bi与PT-Tri的差异表达基因。研究人员认为这些基因是在至少一个被比较组织的所有重复中TPM≥10的基因，即log2FC≤-2和log2FC≥2。在PGs和PT-Bi之间总共检测到301个DEGs，在PGs和PT-Tri之间检测到220个DEG，在PT-Bi与PT-Tri之间检测到26个DEG。为了进一步了解雄配子体从生殖细胞向三细胞生殖细胞转变过程中的功能信息，研究人员分析了DEG的、由MapMan定义的生物学过程。尽管每次比较中的许多DEG都不属于任何生物过程，但与PG相比，特别是与细胞壁和细胞骨架代谢、蛋白质降解和合成以及转录调节、信号传导和转运相关的基因，在PT-Bi和PT-Tri中上调。在PT-Bi与PT-Tri比较中，只发现了少数上调的DEG，它们主要与应激反应有关。
此外，研究人员分析了PG、PT-Bi和PT-Tri阶段之间的转录组动力学，并通过k均值聚类分析确定那些具有相似表达模式的基因(图5)。三个雄配子体阶段显示了9759个表达基因的重叠，并分布在七个k均值聚类中。包含2594个基因(占所有重叠基因的26.58%)的最大聚类2在所有样本中显示了相当高的表达水平。七个聚类中有六个出现了阶段特异性模式，但总体而言，转录水平变化不大(如PTs下调至50%，而组群3中的PGs下调至50%)。聚类1和聚类4(总共约25%的重叠基因)显示在PT生长期间基因上调。这些基因与拟南芥编码RALF、LRX和BUPS的基因同源，以及其他受体激酶，如PRKs。聚类6和聚类7(共约22%的重叠基因)显示在PT-Bi阶段基因瞬时上调。在这些基因中，有一种多聚半乳糖醛酸酶QRT3，据报道它在小孢子发育过程中降解花粉母细胞壁。此外，这些基因包括一种类似于AtOFT1的蛋白质，其突变会产生较低的结实率和降低的生育力。最后，聚类3和聚类5(总共约26%的重叠基因)显示了在PG生长期间下调的基因，包括转录调节因子的同源物，如AtPV42a和AGL104，MIKC MADS基因的成员，以及其他转录因子，如bZIP34。与细胞周期相关的基因，后期促进复合物/环体(SAMBA)的调节剂或肌动蛋白组织的调节剂，如环化酶相关蛋白1 (CAP1)也下调，而信号蛋白的同源物，如花粉特异性受体激酶(PRK3和PRK6)和GTPase (ROP1)的花粉特异性RHO相关蛋白仅轻微下调。
研究人员还探索了与孢子体样品相比，哪些基因在雄性配子体组织中富集。为此，在给定组织中平均TPM≥1且在所有组织(胚珠、叶、花被和根)中TPM≥3的互叶梅基因被认为在该组织中富集或优先表达。该标准可以潜在地识别在给定组织中富集的具有相同监测值的基因。根据这一标准，在雄配子体组织中优先表达的基因在PG中为470个，在PT-Bi中为652个，在PT-Tri中为611个(表1)。这些基因包括花粉特异性基因，但是总体表达水平在三个阶段是相似的。总之，三个不同的雄配子体特殊阶段的转录组非常相似，绝大多数基因表达水平相当。
表1. 九种互叶梅组织的转录组数据。
图4. 互叶梅三个雄配子体阶段和四个孢子体控制组织的转录组Venn图和PCAs。A 在成熟的双细胞PGs和萌发的PGs分别在PGs双细胞和PGs三细胞期三个生物重复中表达基因的重叠。B 孢子体组织中表达基因的重叠。C 三个生物重复中表达基因的主成分分析图。D各组织比较的主成分分析图。
图5. 聚类可视化分析互叶梅从PGs向三细胞PTs转变过程中的转录组动态。
3 在互叶梅中鉴定拟南芥雄配子体功能必需基因的推定同源物
为了理解互叶梅特定的雄配子体功能，研究人员接下来探索了三个发育阶段中30个表达最强的基因。这些基因表达TPM值高达88000，相应的预测蛋白质与其他描述的蛋白质没有显著的相似性，因此是功能研究的主要对象。在PG、PT-Bi和PT-Tri样品中30个表达最强的基因中，研究人员发现15、13和14个基因分别与已知蛋白质缺乏同源性。其他高表达基因与编码快速碱化因子(RALFs)、具有Gly‐Asp‐Ser‐Leu基序的脂肪酶/酰基水解酶、过敏原蛋白、转化酶和果胶裂解酶的基因同源。因为许多对雄配子体功能至关重要的基因，包括PT极性、PT细胞壁、运输、生理、生长和引导以及精子释放，已经在模式开花植物拟南芥中得到表征。研究人员接下来研究了互叶梅相应同源基因的表达谱。研究人员在拟南芥的PGs和PTs中搜索了200多个已知功能的同源基因，基于“最佳匹配”的BLASTp方法，在互叶梅中鉴定了许多同源基因。在30个最强表达的互叶梅同源物中，研究人员鉴定了编码细胞壁蛋白如果胶甲酯酶的基因，包括AtPPME1、VANGUDE 1(VGD1)、RALF4。前30个同源性列表中的大多数基因编码参与信号传导的蛋白质，包括许多受体激酶，如BUPS1和BUPS2，以及小的GTPase，如来自ROP1和拟南芥RAB GTPase的同源物D2B(RAB2B)和RABD2C的RHO相关蛋白质，但研究人员也发现了MADS蛋白结合结构域(MIK) C型MADS转录因子。通过BLASTp搜索，无法确定在PG中表达的253个基因、在PT-Bi中表达的346个基因和在PT-Tri中表达的331个基因的同源物。
如图3所示，互叶梅的细胞壁由果胶和愈伤质组成，类似于拟南芥和其他真双子叶植物和单子叶植物的PTs。因此，细胞壁合成和修饰酶似乎是保守的，像小的GTPases这样的一般信号成分也是如此。为了研究互叶梅花粉功能中关键信号通路的保守性，研究人员接下来重点研究了不同类别受体激酶(RLKs)的表达模式。为了鉴定在拟南芥和互叶梅花粉中表达的同源和推定的同源RLKs，研究人员首先从系统发育的角度比较了注释的蛋白质序列，并研究了相应基因的表达模式(图6)。在拟南芥中，特别是最大的RLK亚家族成员，LRR-RLKs，已被证明在PT生长中具有关键功能，包括PRKs、MDIS1和MIKs，以及BARK1、SRF4/5、CRK1和RK1。这些与在互叶梅中鉴定的所有95个LRR-RLK一致(图6A)。基于系统发育树和表达模式，研究人员鉴定AMTR_s00130p00117400为拟南芥MDIS1和MDSI2的假定直系同源物，AMTR_00025p00206890是PRK1、PRK2、PRK4、PRK5和PRK7的单一同系物，而AMTR_00024p00252010是PRK3、PRK6和PRK8的唯一同系物。编码与拟南芥MIK1和MIK2以及SRF4和SRF5系统发育相关的互叶梅蛋白质的基因在PTs中没有显示出显著的表达模式，类似于与拟南芥CRK1和RFK1在同一分支中的蛋白质。与拟南芥BARK1 系统发育相关的LRR-RLK仅在PTs中显示弱表达水平。在PTs中适度表达的互叶梅基因如AMTR_00010p00238570和AMTR_00077p00153450在拟南芥中不具有LRR-RLK同源物。大多数其他互叶梅LRR-RLK基因不是在所研究的组织中表达，就是在营养组织中表达。
另一个被称为CrRLK1Ls的RLK亚类如图6B所示。这个亚类在拟南芥中有17个成员，在互叶梅中有9个成员。表达模式和序列相似性表明，AMTR_00024p00049240和AMTR_00045p00071050是拟南芥BUPS1和BUPS2的系同源物，而AMTR_s00016p00259140似乎是ANX1和ANX2的唯一直系同源物。RLK拟南芥家族成员数量的增加似乎是一个普遍的特征，这表明基因的重复和多样化尤其有助于RLK基因在进化的更年轻的被子植物物种中的扩展。编码RALFs的基因证实了这一发现，RALFs作为配体与CrRLK1Ls相互作用，但也与位于细胞壁的LRX蛋白相互作用。虽然拟南芥基因组编码37个RALF基因，互叶梅仅包含9个基因，其中4个在雄配子体中显著表达(图6C)。AMTR_s00022p00078480和AMTR_s00044p00139580可能是在PT生长期间调节细胞壁稳定性的假定的RALF4/19直系同源物，而AMTR_s00045p00207290和AMTR_s00067p00137560是一个独特的分支的成员，这些基因的功能尚未阐明。总之，系统发育分析和表达模式分析成功地鉴定了拟南芥RLKs及其配体的直系同源物，这些配体在互叶梅植物的种子萌发和生长中具有关键功能。
图6. 进化树和热图鉴定互叶梅与拟南芥的直系同源物。A LRR-RLKs在互叶梅中被鉴定(95个基因)，其在拟南芥中主要在PTs中表达(24个基因)。B 在互叶梅(9个基因)和拟南芥(17个基因)中鉴定的CrRLK1L受体基因。C 在互叶梅(9个基因)和拟南芥(37个基因)中鉴定的RALFs。
4 蛋白质组学研究表明，互叶梅PGs与萌发有关，并且PGs具有分解代谢、生物合成和运输过程的特征
蛋白质组学分析比较了成熟的互叶梅和三细胞PTs雄配子体功能。两个样品的三个重复的总蛋白提取物通过SDS-PAGE分离并银染(图7A)。PG和PT样品明显显示出不同的条带模式，表明蛋白质水平存在显著差异。蛋白质组分析共检测到2632个蛋白质。在PG样品中鉴定出1667个蛋白质，在PT样品中鉴定出2288个蛋白质。维恩图显示三个PG和PT重复分别有64.1%和68.4%的重叠(图7B)。另一项主成分分析将PG和PT的三个生物重复品紧密地组合在一起，并且彼此显著地分开(图7C)。这些结果表明PG和PT的蛋白质组明显不同，而生物重复非常相似，因此可分析。
研究人员只考虑在所有三个生物重复中同时检测到的来自PG (1086)或PT (1581)的蛋白质。其中，270个蛋白质在PG中显著富集，926个在PT样品中显著富集。然而，分别只有11%和15%的表达基因被检测到，因此很难比较转录组和蛋白质组数据。为了阐明这些富集蛋白所代表的相应生物过程，进行了功能类别分析(图7D)。富集的功能类别被分为主要的生物过程。在每个生物过程中，提供了来自PG(红色)和PT(蓝色)的蛋白质总数。氧化还原过程对PG尤为重要，PG富含与电子传递链相关的蛋白质、参与活性氧生物合成和对氧化应激反应的蛋白质。此外，与氧化脂质生物合成和脂质转运以及碳水化合物代谢相关的蛋白质得到了富集。总之，这表明PG与发芽紧密相关，因此需要大量的能量、脂质和糖。参与细胞壁组织/生物合成的蛋白质进一步支持了这一假设。PT的特征在于与生物合成、分解代谢和运输相关。碳水化合物、核苷酸、脂肪酸、羧酸和氨基糖分解代谢需要许多蛋白质，同时生物合成过程在生成脂质、蛋白质和一般大分子(包括细胞壁物质)中起着主要作用。
除了像PG细胞壁生物合成这样的例外，在蛋白质组数据中没有检测到许多参与PG/PT特异性功能(如信号传导过程)的蛋白质。然而，通过分析拟南芥PGs和PTs中已知功能的200多个基因的推定同源物，研究人员还从蛋白质组数据中的28个互叶梅直系同源物 (表2)。这些同源物包括VGD1和AtPPME1，以及LRX9到LRX11蛋白的单一同源物。还检测到了PRK1、PRK2、PRK4、PRK5和PRK7的单个假定互叶梅直系同源物。在花粉膜和细胞壁组分中没有检测到来自其他高表达信号蛋白如RALFs或BUPS/ANX RLKs以及其他PRKs和膜转运蛋白，或者尽管转录水平高，但由于蛋白质含量低，可能没有检测到。最后，一些蛋白，如动力蛋白和肌动蛋白丝集束蛋白或小的GTPases，它们表达较低，但在PG或PT的所有样品中均有检测到，表明它们的高稳定性和低转换率。总之，蛋白质组分析表明，PGs似乎为萌发做好了充分准备，需要脂质、能量，但也可能需要活性氧信号，而PTs的特点是分解代谢/生物合成和转运过程。
图7. 互叶梅PGs和三细胞PTs的蛋白质组学分析。A 发芽后17小时观察到的蛋白特征图谱。B 在PGs和PTs三个生物重复中检测到的蛋白质数量。C 在PG和PT样品的三个生物重复中检测到的蛋白质主成分分析图。D 根据已鉴定蛋白质的生物学过程的功能类别分布。
表2. 利用蛋白质组学分析鉴定的拟南芥与互叶梅的同源基因。
结论
阐明互叶梅如何以及是否能区分自身和外来PGs、PT调节机制是否存在以及在姐妹支被子植物中缺乏同源物的互叶梅雄配子体中高特异性表达基因的作用是接下来的重点工作。本研究的数据可用于比较基因表达研究，也可用于选择候选基因和蛋白质结构域，以研究被子植物繁殖和多样化过程中的蛋白质进化，并可用于补充例如拟南芥和其他物种中的相应突变体。互叶梅雄配子体特异性基因的功能研究因为没有稳定的转化系统，并且该物种的组织培养具有挑战性仍然非常困难，。然而，互叶梅雄配子体特异性基因在其他物种中的过度表达研究、瞬时PT转化系统的开发以及姐妹支被子植物如拟南芥和玉米中生殖突变体与互叶梅基因的互补方法可以显著理解生殖基因家族的进化，从而更好地理解互叶梅和一般开花植物中生殖机制的进化。
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